Способ определения дозы сенситина,необходимой для получения эритропитарного диагностикума

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОЗЫ СЕНСИТИНА, НЕОБХОДИМОЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЩНАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА, путем анализа сенсибилизированных разными дозами сенситина эритроцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, определяют среднюю электрофоретическую подвижность сенсибилизированных эритроцитов и используют дозу сенситина , при которой отношение электрофоретической подвижности к среднеквадратичному отклонению равно 0,080 ,160,

„„SU„„1 3 24229

ССЮЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИИ

3Ш С 01 N 33/48, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3607691/28-13 (22) 17.06.83 (46) 15.11.84. S Ф 42 (72) А.И. Иирошников, А.В. Темнов, М.B. Äóëàòoâà, О.В. Савицкая, А.10. Иванов, Б.И. Фейгельман,Н.К. Призова, А.К. Анфиногенова, В.Н. Алексеева и С.Н. Головачева (71) Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (53) 612. 115(088.8) (56) 1. Регламент производства эритроцитарных диагностикумов Р 81-77, утвержденный 16.04.77 начальником

Главного управления по производству бактерийных и вирусных препаратов

Минздрава СССР, с. 85. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОЗЫ

СЕНСИТИНА, НЕОБХОДИМОЙ ДПЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ЗРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУИА, путем анализа сенсибилизированных разными дозами сенситина эритроцитов, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, определяют среднюю электрофоретическую подвижнОсть сенсибилизированных эритроцитов и используют дозу сенситина, при которой отношение электрофоретической подвижности к среднеквадратичному отклонению равно 0,080,160 °

1124229

Изобретение относится к вакцинно. сывороточному целу и может быть использовано в технологии получения эритроцитарных диагностикумов ветеринарного и медицинского назна5 . чения.

Известен способ определения дозы сенситина, необходимой для получения эритроцитарного диагностикума, путем анализа сенсибилизировайных разными дозами сенситина эритроцитов. Определение дозы сенситина осуществляется методом пробчых посадок, предусматривающим изготовление пробных образцов препарата, различающихся дозиров-15 кой сенситина. Пробные образцы готовят сенсибилизацией эритроцитов в дозе 62, 125 и 250 мкг антигена на

1 мл эритроцитарной взвеси. Затем проводят реакцию непрямой гемагглютина- ции (РНГА) с соответствующей контрольной кроличьей сывороткой. Для получения производственной серии диагностикума выбирают ту из указанных трех доз сенситина, которая агглютинирует-25 ся контрольной сывороткой в разведении до 1/2 титра (1 J.

Известная методика не позволяет определить оптимальную дозу сенситина из-за того, что взят очень большой

30 интервал изменений его концентрации.

Если же выбрать меньший интервал изменения концентрации антигена, то с помощью РНГА не удается обнаружить разницу в соответствующих разведениях контрольной сыворотки, т.е. РНГА применительно к рассматриваемой задаче является неточной, мало чувствительной. В то же время, заниженная доза антигена ухудшает чувствительность и специфичность 40 диагностикума, а завышенная может. привести к спонтанной агглютинации.

Другим недостатком известного способа является труднодоступность контрольных сывороток, так как они должны быть получены от больных соответствующей инфекцией, вплоть до инфекции, вызванной определенным штаммом возбудителя. При этом очевидно, что контрольные сыворотки мо- >0 гут отличаться нестабильностью титров, поскольку они.получены от разных больных.

Таким образом, основная причина несовершенства известного способа 55 заключается в трудности установления точной оптимальной дозы сенситина.

Цель изобретения — повышение оч-, ности способа.

Указанная цель достигается тем, что по способу определения дозы. сенситина, необходимой для получения эритроцитарного диагностикума, путем анализа сенсибилизированных разчыми дозами сенситина эритроцитов, определяют среднюю электрофоретическую подвижность сенсибилизированных эритроцитов и используют дозу сенситина, при которой отношение электрофоретической подвижности к среднеквадратичному отклонению равно 0,8-0,160, Пример 1. Образцы двух партий эритроцитов баранов, фиксированных формалином и разведенных до

i0X-ной суспензии физраствором, соединяют с равными объемами растворов полисахаридного антигена шигелл Зонне при концентрациях последнего 25-250 мкг/мл. Для проведения данной операции используют пробы объемом по 5 мл. Реакционные смеси выдерживают в течение 1 ч при 37 С. Затем сенсибилизированные эритроциты трехкратно отмывают от избытка антигена физиологическим раствором при рН 7,2.

Осадок разводят до первоначального объема (т.е. до 5 мл) раствором, содержащим: мясо-пептонный бульон Хоттингера 25 об.Ж; сахароза 5 вес.7.; боратно-янтарный буфер рН 7,5 остальное .

Приготовленные пробные образцы лиофилизируют. Далее измеряют электрофоретическую подвижность эритроцитов в пробных образцах. С этой целью их предварительно размачивают каждый в 5 мл дистиллированной воды, после чего центрифугируют в течение 5 мин при g = 350. Полученные осадки сенсибилизированных различными дозами антигена эритроцитов растворяют каждый в 6 мл измерительной среды с параметрами:ионная силац0,02;рН 7,3ф 25 С, Электрофоретическую подвижность измеряют методом микроэлектрофореза на приборе ПАРМОКВАНТ-2 (Карл

Цейсс, Йена) в режиме автоматического анализа электрофоретической подвижности (V) и среднеквадратичное отклонение (6 ) в пробных образцах ста эритроцитарных клеток..Затем рассчитывают отношени " V/5 для каждого пробного образца.

В табл. 1 дана характеристика пробных образцов эритроцитарного дизентерийного диагностикума Зонне

1124229

Таблица 1

Партия эритроцитов

Сенсибилизирующая доза, мкг/мл

Показатели контролируемых образцов

200

250

100 150

1,91 1,78

9,5 8,9

0,20 0,20.

1, 55 1,04

5,6 12,8

0,28 0,08

1,30

1,62

1,21

1,42

9,6

9,9

12,6

V/d"

0,14

0,10

0,14

0,15

0,77

1,05 0,91

14,7 15,8

0,07 0,06

13,9

V/d

0,06

Сенсибилизирующая доза, мкг/мл

Показатели контролиПартия эритроцитов

300

25 руемых образцов

1,34

1,45

1,48

1,64

11,8

10,9

8,9

7,7

Как видно из таблицы, для первой .партии эритроцитов минимальной сенсибилизирующей дозой, для которой отношение V/C находится в предлагаемом диапазоне, является 100 мкг/мл (при этой нагрузке отношение составляет О, 15). Поэтому данную дозу используют для получения целевого продукта (большие дозы применять нецелесообразно из экономических соображений, хотя для них коэффициент нагрузки и находится в предлагаемом диапазоне).

В результате сенсибилизации эритроцитов первой партии антигеном шигелл Зонне в дозе 100 мкг/мл с.последующим выполнением операций отмывки и лиофилизации в режимах, указанных выше для приготовления пробных образцов, получают сухой эритроцитарный антигенный диагности-. кум дизентерии Зонне, имеющий титр в РНГА с сыворотками больных от

1/200 и выше, а с сыворотками здоровых доноров 1/2. При этом титр .,препарата в РНГА с иммунными кроличьи-. ми сыворотками составляет 1/6400.

Согласно табл. 1, для второй партии эритроцитов сенсибилизирующей дозой является 50 мкг/мл, так как при этой дозе V/б = 0,08.

В результате сенсибилизации эритроцитов второй партии антигеном шигелл Зонне в дозе 50 мкг/мл получают диагностикум с титром в РНГА с сывороткой больных от 1/100 и выше, с сыворотками здоровых доноров 1/2, 30 а с имунными кроличьими сыворотками

1/3200.

Пример 2. Образцы двух партий эритроцитов баранов, фиксиро.ванных формалином и разведенных до

10Х-ной суспензии физраствором, соединяют с равными объемами растворов полисахаридного антигена шигелл

Ньюкэстл при концейтрациях последнего

40 25-300 мкг/мл, Последующие операции

:по изготовлению и контролю пробных образцов. проводят, как описано в примере

45 Результаты контроля пробных образцов приведены в табл. 2.

Таблица 2

100 200 250

11 24229

Продо

0,17

v/g

0,21

0,13

0,11

2 t,97 1,93

8,3 9,0

0 24 Ою 21

1,74

1,87

1,75

1,73

9,3 10,6

0,20 0,16

О"

V /д"

10,7

10,9

0,16

0,16

Составитель Е. Житннкова

Редактор И. Рыбченко Техред 1К.Кастелевич Корректор A Тяско

Заказ 8272/34 Тираж 822 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Из данных табл, 2 видно, что для обеих партий эритроцитов оптимальной сенсибилизирующей дозой антигена 20 шигелл Ньюкзстл является 200 мкг/мл.

Коэффициенты нагрузки эритроцитов данной дозой антигена равны 0,13"и

О, 16 соответственно.

В результате сенсибилизации бараньих эритроцитов обеих партий антигеном шигелл Ньюкэстл в дозе

200 мкг/мл получают эритроцитарный антигенный диагностикум дизентерии

Ньюкэстл, имеющий титр в РНГА с сыво-30 ротками больных 1/200-1/800, а с имунными кроличьими сыворотками

1/6400.

В результате применения предлагае- мого способа упрощено и ускорено определение точной дозы сенситина, используемой для сенсибилизации эритроцитов при получении диагностикума, за счет исключения необходимости испытания пробных образцов препарата с труднодоступными сыворот-! ками больных; экономится дорогостоящее сырье (сенситин) благодаря точному и быстрому определению величины сенсибилизирующей дозы (поскольку ранее приходилось преднамеренно завышать сенсибилизирующую дозу антигена для обеспечения гарантии в отношении чувствительности диагностикума);-повышена культура производства за счет аппаратурного оснащения и количественного выражения процесса сенсибилизации.