Штамм @ @ @ -82-продуцент холестериноксидазы

 

ШТАММ STREPTOMCES LAVENDULAE ИНМИ А 8-2 (Всесоюзная коллекция микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер А - 840 Д) ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ,

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

CONV

РЕСПУБЛИК аа (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3623077/28-13 (22) 13. 07. 83 (46) 23. 11.84. Бюл. К 43 (72) А.А. Имшенецкий, Г.А. Ширшова, С.А.Куликов, Л.Н.Мунтян, Т.С.Назарова и Л.Е.Никитин (71) Институт микробиологии АН СССР (53) 577.15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Р 734264, кл. С 12 И 15/00, 1978.

2. Европейский патент Ф 0020311, 1982 (йрототипу.

ЗСЮ С 12 Й 15/00; С 12 N 9/04;

С 12 R 1/56 (54)(57) ШТАИИ STREPTOHYCES LAVENDULAE HHMH А 8-2 (Всесоюзная коллекция микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер А — 840 Д)ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ.

1125250

Изобретение относитеся к микробиологическому синтезу ферментов и может быть применено для получения холестериноксидазы.

Известен продуцент холестериноксидазы $йгeptomyces lavendulae

ВКИ-А-591, который при культивировании на среде, содержащей глюкозу, аспарагин, дрожжевой экстракт и холестерин в качестве индуктора, в 10 аэробных условиях образует до

2 г/л биомассы с активностью 3045 ед/г (1).

Недостатком этого продуцента является невысокая холестериноксидазная активность, а также то, что при культивировании.на жидких средах

Str..1avendulae ЗКИ-А 591.образует пигменты меланоидного типа, затруд-: няющие получение и очистку фермент- 20 ного препарата.

Наиболее близкими к изобретению по технической сущности и достигаемому .положительному эффекту являются продуценты холестериноксидазы Str. 25

hygroscopicus, а также Str. griseo"

fuscus и Зйг. acidomycesicus. При культивировании на,среде сложного сос-.ава, содержащей дорогостоящие компоненты, такие как пептон, крахмал и.дрожжевой экстракт, в течение длительного срока(3-4 сут) в клетках актиномицетов содержится 106,!

284,6 ед/г холестериноксидазы Pj .

Недостатком цветных продуцентов является то, что выращивание прово35 дят в течение длительного срока на многокомпонентной дорогостоящей среде. Целью изобретения является штамм—

1 40 продуцент холестериноксидазы, обладающий высокой активностью при выращивании на среде простого состава в течение 1-2 сут и не образующий пигментов при культивировании на применяемых средах. !

Полученный штамм Streptomyces

lavendulае ИНИИ- А8 — 2(коллекция института биохимии и физиологии микроорганизмов, коллекционный номер

ВКИ А-840 Д), являюшийся высокоактивным продуцентом холестериноксидазы, обладает следующими признаками.

Культурально"морфологические признаки штамма. На,агаризованной среде CP-1 Красильникова колонии

7-10-ти суточного возраста белого цвета, гладкие, плоские, с ровными краями, диаметром 8-10 мм, пигмента не образует.

На среде Гаузе-1 колонии розоватолилового цвета(цвет лаванды), гладкие или складчатые, диаметром до

8 мм, субстратный мицелий пепельносерого цвета, пигемента не образует.

На картофельном агаре рост в виде крупных (10 мм)колонии белого или слегка розоватого цвета, воздушный мицелий хорошо развит, белого цвета, субстратный мицелий бурого цвета, пигмент не образует.

На.МПА растет плохо, воздушный мицелий не образует, колонии светложелтого цвета, 5-7 мм в диаметре, пигмент не образует.

Ф

На сусло-агаре колонии розоватолилового цвета с хорошо развитым воздушным мицелием, 8-10 мм в диаметре, субстратный мицелий темносерого цвета.

Физиологические признаки. Желатину разжижает, молоко коагулирует и пептонизирует, Сероводород и индол не образует. Нитраты не восстанавливает. В качестве источника углерода потребляет глюкозу, фруктозу, маннит и ксилозу. Не потребляет сахарозу, рамнозу и инозит. На ломтиках картофеля растет обильно в виде серого налета.

Оптимальная температура роста

28-30 С. При 37 С рост слабый, при

45 С вЂ” не растет. о

Обладает антибиотической актив— ностью против граммоположительньгх и граммотрицательных бактерий.

Штамм выделен из популяции коллекционного штамма Streptomyces

lavendulae K 4004.

При культивировании на жидкой питательной среде определенного состава образует холестериноксидазу, активность которой составляет 170,5—

380, 5 ед. на грамм сухой биомассы.

Сравнение преимуществ предлагаемого штамма с известными продуцентами приведено в таблице.

Пример 1. В качестве исходного посевного материала используют ! культуру, выращенную на скошенном агаре в течение 10 сут и хранящуюся в холодильнике при 5 С. Применяют среду следующего состава г/л: глюко5 за 20,0; NH N032 0; СаСО 1,0; белково-витаминный концентрат 3,0; вода водопроводная с рН 7,2. Среду разливают в широкие пробирки по 7 мл и ором

Streptomyces

griseofuscus

Не влияет

141,8-223,6

Strep

hygrosopicus

126,0-252,0

142,3-284,6

Не влияет.

Streptomyces

acidomyceticus

72,1-144,2

71,1-!42,2!

О8 1-216,3

106,6-213,2

Streptomyces

1aveudu1ae

BKM-А 591

30,0-45,5

I 5-.4,5

Streptomyces

>lavendulae BKM А-840 1 предлагаемый штаюю и

170,5-380,5

Не влияет

ВНИКНИ Заказ 8435/18 Тираж 521 Подписное

Филиал ППП "Патеат", г.Ужгород, ул.Проектная, 4

3 1125 колбы Эрленмейера на 250 мл о 70 мл.

Смывом со скошенного агара засевают среду в пробирках(0,2 мл на 7 мл средь . Выращивание проводят на качалке с 240 об/мин в течение 48 ч при

28 IC: Полученной жидкой культурой засевают среду в колбах(7 мл культуры на 70 мл среды). Выращивание проводят на качалке с 190 об/мин в течение 22 ч при 28 С. ФО

Биомассу отделяют на центрифуге при 5000 об/мин и промывают 1/15 И фосфатным буфером. Холестериноксидазную активность определяют по опи- санной методике. За единицу холестериноксидазной активности принимают количество микромоль холестеиона, образующегося под. действием холесте риноксидазы из холестерина за 1 мин при 37 С ° . Ю

Активность биомассы составляет

380,5 ед. на 1 г.

П р и.м е р 2. Штамм Str.laveadulae BKM - А840 выращивают в ферментере емкостью !00 л. Объем среды 28 л.

Состав среды г/л: глюкоза 28,0;

NHgN0>2,0; СаС0 2,0; белково-витамин" ный концентрат 3,0, рН 6,9. Среду

250 4 в ферментере засевают 48-ми часовой жидкой культурой, выращенной на среде того же состава в колбах на

3 л. Объем посевного материала на ферментер 2,0 л. Выращивание прово.дят 22 ч. Биомассу отделяют сепари-рованием, дважды .промывают дистиллированной водой. Получают 3,0 г/л биомассы с холестериноксидазной активностью 364,0 ед. на 1 r.

Холестериноксидаза, полученная из биомассы предлагаемого штамма, может найти применение как реагент для клинических анализов при количественном определении холестерина, а также может представить интерес как средство для снижения уровня холестерина в крови. Высокая холестериноксидазная активность продуцента и отсутствие пигмента в биомассе и культуральной жидкости позволяет значительно повысить выход фермента и упрощает процесс очистки ферментного препарата.

На опытной установке ИНИН АН СССР получены партии ферментного препара" та холестериноксидазы, которые были очищены в 5-7 раз.