Способ выделения нуклеозид-5-монофосфорных кислот

 

1. СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОЗИД-5-ШНОФОСФОРНЫХ КИСЛОТ из смеси, образующейся при фосфорилировании нуклеозидов галогенпроизводными фосфорных кислот в полярном органическом растворителе, путем нанесения на колонку, заполненную катионитом в Н -форме, с последующим элзоированием водой и выделением целевого продукта, упариванием элюата, о тличающийся тем, что, .с целью упрощения процесса, реакционную смесь; непосредственно после фрсфорилирования наносят на 3-25кратный объем сорбента, предварительно уравнов|гшенного полярным растворителем, и элюируют при 1-20 С. 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что при выделении аденози1н-5-монофрсфата используют 3-5-кратный объем .сорбента, а элюирование осуществляют-при 1-5 С. 3.Способ поп.1,отличающ и и с я тем, что при выделении шшзин-5-монофосфата испольэуют 510-кратный объем .сорбента, а элюирование осуществляют.при 10-15 С. 4.Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что при выделении цитидин-5-монофосфата используют 10-15-кратный объем сорбента, а элюирование осуществляют при 15 (/) . 5.Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что при выделении гуанозин-5-монофосфата используют 10-15-кратный объем .сорбента, а элюирование осуществляют при 5-10 С. 6.Способ по п. 1., о т л и ч а ю щ и и с я тем, что при выделении уридин-5-монофосфата. используют 20-25-кратный объем сорбента, а элюирование осуществляют при 15-20 С.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) 01) А зао С 07 Н 19. ОО

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,К СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3448880/23-04 (22) 01 06. f2 (46) 15. 12. 84. Бюл. № 46 (72) В.А.Озола, Я.А.Шписс, И.P.×àêñòå и У.Я.Микстайс (53) 547.963.32(088.8) (56) 1. Патент США ¹ 3413282, кл. 260-211.5, опублик, 1966.

2. Авторское свидетельство СССР № 487887, кл. С 07 Н 19/00, 1973.

3 ° Патент США № 3201389, кл. 260-211.5, опублик. 1962(прототип). (54) (57) 1. СПОСОБ ВЬДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОЗИД-5-ИОНОФОСФОРНЫХ КИСЛОТ из смеси, образующейся при фосфорилировании нуклеозидов галогенпроизводиыми фосфорных кислот в полярном органичес-. ком растворителе, путем нанесения на колонку, заполненную катионитом в Н -форме, с последующим элюироваt» нием водой и выделением целевого продукта. упариванием элюата, о тл и ч а ю шийся тем, что, .с целью упрощения процесса, реакционную смесь непосредственно после фосфорилирования наносят на 3-25- кратный объем сорбента, предварительно уравновешенного полярным о растворителем, и элюируют при 1-20 С.

2. Способ по п. 1, о т.л и ч а— ю шийся. тем, что при выделении аденозин-5 -монофосфата используют

3-5-кратный объем сорбента а элюирование осуществляют.при 1-5 С.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю" шийся тем, что при выделении инозин-5-монофосфата используют 5-!

10-кратный объем .сорбента, а злюирование осуществляют.при 10-15 С. о

4. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что при выделении

1 цитидин-5-монофосфата используют.

10-15-кратный объем сорбента, а . злюирование осуществляют при 1520 С.

5. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что при выделении гуанозин-5-монофосфата используют

10-15-кратный объем .сорбента, а элю ирование осуществляют при 5-10 С. о

6. Способ по п. 1., о т л и ч а— ю шийся тем, что при выделении

1 уридин-5-монофосфата.используют

20-25-кратный объем, сорбента, а элю ирование .осуществляют при 15-20 С.

t !129

Изобретение относится к области химии, конкретно, к усовершенствованному способу получения нуклеозид5"монофосфатов, используемых в производстве различных производных нуклеотидов для.научно- исследовательских работ в области молекулярной биологии и генетики.

Нуклеозид-5-монофосфаты получают гидролизом рибонуклеиновой кислоты, !о или химическим фосфорилированием нуклеозидов с последующим выделением целевых продуктов хроматографическими методами.

Наиболее перспективный из химических способов получения нуклеотидов является способ фосфорилирования галогенпроизводными фосфорных кислот, в среде, содержащей полярный органический растворитель )1) и (2$

Реакционная смесь после фосфорилирования нуклеозидов галогенпроизводными фосфорных кислот известными способами (1) и (2) содержит в основном хлорангидрид нуклеозид — 5-монофосфорной кислоты, непрореагировавший остаток нуклеозида, остаток фосфори-. лирующего агента и полярный органический растворитель(например, триалкилфосфат, ацетонитрил, пиридин).

Известен, например, способ выделения целевого продукта из данной реакционной смеси (1), заключающийся в том, что реакционную смесь после проведения синтеза гидролизуют водой и далее после нейтрализации разделяют полученные при этом продукты на колонке с анионитом в формиатной форме. ! Недостатками известного способа анионного обмена являются большие 40 объемы колонок с,анионитом.

Кроме того, полученные растворы с нуклеозид-5-монофосфорных кислот имеют очень высокую кислотность (ply(1) . При такой кислотности abpe45 лять непосредственно нуклеозид-5монофосфорные кислоты невозможно из-за их неустойчивости и повышенной растворимости в кислотах. Поэтому полученные растворы нейтрализуют и целевой продукт выделяют в виде соли.

Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения нуклеозидI

5-монофосфорных кислот из реакционной 5 смеси, образующейся в процессе фосфорилирования хлорпроизводными фосфорных кислот 2,3 -0-защищенных нуклео213 2 эндов, в котором использовано свойство нуклеотидов существовать в катионной форме (3) .

Согласно известному способу, реакционную смесь после.фосфорилирования гидролизуют водой. Образовавшуюся соляную кислоту удаляют в виде соли четвертичного амМониевого основания (например, солянокислого пиридина).

Фосфорную кислоту нейтрализуют раствором гидроокиси бария или лития и отфильтровывают в виде фосфата бария или лития.

На колонке с катионитом в Н-форме разделяют затем 2,3 -0-защищенный нуклеозид-5-монофосфат и соответl ствующий нуклеозид. На 1 объеь сорбента наносят 1 объем водного раство1 l ра разделяемой смеси. 2,3-0-изопро-

I пилиден нуклеоэид-5-монофосфат элюируют водой. 2,3-0-ИзопропилиденI нуклеозид-5-монофосфат затем самопроизвольно разлагается на нуклео-! зид-5-монофосфорную кислоту и ацетон в течение 1-3 ч, рН полученного таким образом раствора водным раствором щелочи доводят до 4.

Раствор концентрируют,, нейтрализуют (рН 7) раствором щелочи. Образовавшуюся соль высаживают этанолом, отфильтровывают и сушат. Получают соли нуклеозид-5-монофосфорных кислот с выходом 60-80Х.

Полученные соли переводят в соответствующие кислоты, пропуская их через колонку с катионИтом в

Н -форме. Элюат упаривают в вакууме.

Ф

Выход нуклеозид-5 — монофосфорных кис— лот в известном способе составляет

40-807.

Недостатком известного способа является сложность процесса выделения, высокая кислотность элюата (рН (1,, из которого целевые соедине) ния получают в виде солей. Свободные

I нуклеоэид-5-монофосфорные кислоты известным способом можно получить только путем повторного пропускания водного раствора соответствующей соли через колонку с катионитом в Н форме и упаривания полученного водного раствора.

Цель изобретения — упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения

I нуклеозид-5-монофосфатов иэ смеси, образующейся при фосфорилировании нуклеозидов галогенпроизводнь ми

1!29

3 фосфорных кислот в среде полярных растворителей, путем нанесения на колонку, заполненную катионитом в

Н форме, с последующим элюированием водой и выделением целевого продук5 та упариванием элюата реакционную смесь непосредственно после фосфорилирования наносят на колонку, заполненную 3-25-кратным(по объему количеством катионита в Н -форме, lp

+ предварительно уравновешенного полярным растворителем, колонку элюируют а водой при температуре 1-20 С. Нуклеоэид-. 5-монофосфорные кислоты выделяk ют иэ элюата упариванием.Ьыход составляет 80-90Х в расчете на количество целевого продукта, получившееся при фосфорилировании.

Существенным отличием предлагаемого способа является то, что не производят обработку реакционной смеси водой, что позволяет в одной стадии отделить целевые продукта как . от неорганических примесей, так и от непрореагировавших исходных нуклеози25 дов.

Поскольку элюентом является вода, на колонке происходит гидролиз продуктов, содержащихся в реакционной смеси, с выделением большого количества тепла. Чтобы снизить скорость гидролиза и обеспечить отвод выделяющегося тепла, колонку охлаждают. Разделение проводят о при температуре 1-20 С. При температурах ниже +l. С в случае больших 35 о объемных соотношений в начальном участке колонки при длительном промывании может образоваться лед.

При температурах выше оптимальных резко увеличивается кислотность 4О элюата(следствие усиления гидролиза), что препятствует выделению нуклеозид-5-монофосфорных кислот. оптимальные температурные интервалы для конкретных соединений 45 имеют следующие значения: С .0 (Аденозин- 5-монофосфат +1-+5

Инозин-5-монофосфат +10-+15 1 4

Цитидин-5-монофосфат +15-+20

Гуанозин-5-монофосфат +5-+10 50

Уридин-5-монофосфат +15-+20

Кроме того, раствор целевого продукта после элюирования имеет незначительную кислотность(рН 2-4), что позволяет исключить нейтрализа- 55 цию и получать свободные нуклеозид5-монофос орные кислоты упариванием непосредственно элюата. Такая

213 4 кислотность обеспечивается большим объемным избытком (3-25-кратным) сорбента по сравнению с ооъемом исходной смеси.

Оптимальные 1пля получения свободных нуклеозид-5-монофосфорных кислот объемные соотношения наносимой на колонку пробы.и сорбента установлены экспериментально. При соотношениях ниже оптимальных разделение компонентов (целевого продукта и галогенпроизводных фосфорных кислот недостаточно эффективно, практически, это выражается в том, что кислотность полученного раствора целевого продукта настолько высока, что из него невозможно выделить свободную

l нуклеозид-5-монофосфорную кислоту без дополнительной. обработки. При использовании объемных соотношений выше оптимальных эффективность разделения достаточно высока, однако это не имеет смысла, так как неоправданно увеличивается объем элюанта и размер хроматографической установки.

Получены следующие оптимальные соотношения между об ьемами наноси,мой на колонку пробы и сорбента:

I г

Аденозин-5-монофосфат

1:3-1:5

Инозин-5-MoHo@ocфат 1 †:5 †:10 г

Цитидин-5-монофосфат 1: 10-1: 15 и

Гуанозин-5-монофосфат l-lO-l:15

I)

Уридин-5-монофосфат 1:20-1:25

Кроме того, улу"шения качества разделения достигают путем уравновешивания сорбента перед нанесением реакционной смеси водой или полярным органическим растворителем.

Таким образом, процесс выделения

Л нуклеозид-5-монофосфорных кислот согласно предлагаемому способу заключается в следующем.

Колонну с оболочкой для охлаждения заполняют катионитом и уравновешивают полярным растворителем

Г органическим или водой). Затем на колонку узкой зоной (объем наносимого

1 1: раствора составляет †- . — --- объема

3 25 сорбента} наносят реакционную смесь непосредственно после фосфорилирования.

1129213!

Колонку элюируют водой с температурой +10 С (при этом также охлаждают колонку через оболочку) и собирают вытекающий из колонки раствор.

Первые 5-8 л раствора отбрасывают.

Последующие 4-5 л раствора упаривают при пониженном давлении и целевой продукт из полученного концентрированного раствора осаждают этиловым спиртом. Суспензию охлаждают до о, 30 4 !. и оставляют до полного оседания осадка. Затем осадок фильтруют и сушат.

Получают 12,8 r гуанозин-5-моно1 фосфорной кислоты.моногидрата.

Чистота.98%. Выход. 85%.

Пример 3. Хроматографическую колонку с оболочкой(размеры колонки: диаметр 4 см, высота 100 см) заполняют катионитом КУ.-2 в Н -форме. Объем

+ катионита в колонке 1000 мл. Колонку уравновешивают 1000 мл ацетонитрила.

Затем на колонку наносят 100 мл реакционной смеси, полученной, фосфо-! рилированием 14,6 r инозина 21,6 мл хлорокиси фосфора в 54 мл ацетонитрила 21 3 мл пиридина и 2,7 мл воды, Реакционная смесь содержит !

18 .r инозин-5-монофосфата(определя.ют хроматографическим разделением образца с последующим измерением

50 количества целевого продукта спектрофотометрическим методом).

Колонку элюируют водой с темперао турой +15 С(при этом также охлаждакгт колонку через оболочку) и собирают вытекающий из колонки раствор.

Первые 5-8 л раствора отбрасывают.

Последующие 4-5 л раствора упариКолонку при включенном внешнем охлаждении промывают водой .с температурой +1-+20 С и собирают -вытекающий при этом из колонки раствор.

Первая фракция содержит частично. гидролизовавшийся .непрореагировавший фосфорилирующий агент, растворенный в соответствующем полярном растворителе(в органическом или в воде). Вторая фракция содержит р нуклеозид-5-монофосфаторную кислоту рН этой фракций 2-4.

Раствор нуклеозид-5-монофосфорRoA кислоты(вторая фракция) концентрируют и из концентрированного раст- .!5 вора выделяют целевой продукт.

Получают препараты, содержащие

96-98Х основного вещества. Выход нуклеозид-5-монофосфорных кислот

f составляет 80-90Х в расчете на количество целевого продукта, образовавшегося в реакции фосфорилирования.

Если необходимо получать соли ( нуклеозид-5-монофосфорных кислот, то элюат, содержащий эту кислоту, перед упариванием, нейтрализуют щелочью.

Пример 1. Хроматографическую колонку. с оболочкой (размеры колонки: диаметр-2,5 см, высота-75 см, .заполняют катионитом КРС-4 в H — форме °

Объем катионита в колонке 300 мл.

Колонку уравновешивают 300 мл триметилфосфата.

Затем на колонку наносят 100 мл реакционной смеси, полученной фосфорилированием 14,8 -r аденозина 15,3 мл хлорокиси фосфора в 80 мл (- триметил- . фосфата. Реакционная смесь содержит

V !

6,9 г аденозин-5-монофосфата (определяют спектрофотометрическим методом после хроматографического разделения} .

Колонку элюируют водой с температурой +1 С(при этом также охлаждают колонку ч. рез оболочку) и собирают вытекающий при этом из колонки раствор.

Первые 1-1,5 л раствора, содержащие хлорокись фосфора и триметилфос-. фат, отбрасывают.

Последующие 2-2,5 л раствора (содержит целевой продукт) упаривают при пониженном давлении до появления осадка. Суспензию. охлаждают и ос- . тавляют до полного осаждения. Затем осадок фильтруют и сушат.

Получают .16,3 г моногидрата и аденозин-5-монофосфорной кислоты.

Чистота. 98, Выход. 90%.

Пример 2. Хроматографическую колонку с оболочкой(размеры колонки: диаметр 4 см, высота 100 см) заполняют катионитом КРС вЂ” 4 в Н -форме. Объ.!ем катионита в колонке 1000 мл.

Колонку уравновешивают водой.

Затем на колонку наносят 100 мл реакционной смеси, полученной фосфорилированием 12,65 г натриевой соли гуанозина 12,5 мл хлорокиси фосфора в 85 мл триметилфосфата.

Реакционная смесь содержит 14,1 ryat нозин-5-монофосфата1определяют разделением образца с последующим измерением кол-ва целевого продукта, спектрофотометрическим методом) вают при пониженном давлении и целе

)129213

ВНИКПИ Заказ 9298/19 Тираж 380 Палписное

Филчал ППП "Патент", г.Ужгогод, ул.Проектная, 4 вой продукт из полученного концентрированного раствора осаждают этиловым спиртом. Суспензию .охлаждают до

+4 С и оставляют до полного оседания осадка. Затем осадок фильтруют и 5 сушат.

Получают )5,8 г инозин-5-монофосфорной кислоты.моногидрата. Чистота

96Х. Выход 80Х, Пример 4. Хроматографическую )0 колонку с оболочкой(размеры колонки: диаметр 4 см, высота 130 см) заполняют катионитом КУ-2 в Н -форме. Объем

+ катионита в колонке 1,5 л. Колонку уравновешивают водой. !5

Затем на колонку наносят 100 мл реакционной смеси, полученной фосфорилированием 17 г гуанозина 18 мл пирофосфорилтетрахлоридом в 60 мл ацетонитрила и в присутствии 33 г солянокислой соли пиридина. Реакционная смесь содержит 17 8 r гуанозинI

Ъ

5-монофосфата(определяют спектрофотометрическим методом после хроматографического разделения) .

Колонку элюируют водой с температурой +5 С),при этом также охлаждают колонку через оболочку) . Собирают вытекающий иэ колонки раствор.

Первые 7-10 л раствора отбрасыва30 ют.

Последующие 6-8 л раствора нейтрализуют раствором едкого натрия и лиофилизуют.

Получают 19,2 r дигидрата динатри1 евой соли гуанозин-5-монофосфорной кислоты. Чистота 96Х. Выход 85X.

Пример 5. Хроматографическую колонку с оболочкой(размеры колонки: диаметр 4 см, высота 130 см) заполняют катионитом ÊÐÑ-8 в Н -форме.

Объем катионита в колонке 1,5 л.

Колонку уравновешивают водой.

Затем на колонку. наносят 100 мл реакционной смеси, полученной фосфорилированием 9 г цитидина 6,8 мл хлорокиси фосфора в 92,5 мл триэтилфосфата. Реакционная смесь содержит

10,5 г цигидин-5-монофосфата (определяют спектрофотометрическим методом после хроматографического разделения).50

Колонку элюируют водой с температурой +20 С(при этом также охлаждают колонку через оболочку) . Собирают вытекающий из колонки раствор.

Первые 7-10 г раствора отбрасывают.

Последующие 8-)0 л раствора упаривают при пониженном давлении до появления осадка.. Суспензию о охлаждают до +4 С и оставляют до полного оседания осадка. Затем осадок фильтруют и сушат.

Получают 10,3 г моног щрата ! цитидин-5-монофосфорной кислоты.

Чистота 97Х. Выход 90Х.

Пример 6. Хроматографическую колонку с оболочкой(размеры колонки: диаметр=5 см, высота !40 см)заполняют катионитом КУ-2, в Н -форме. Объ+ ем катионита в колонке 2,5 л. Колонку уравновешивают водой.

Затем на колонку наносят )00 мл реакционной смеси, полученной фосфорилированием 15 г натриевой соли уридина 15 мл хлорокиси фосфора 85 мл триметилфосфата. Реакционная смесь содержит 16,8 r уридин-!

5-монофосфата {определяют спектрофотометрическим методом после хроматографического разделения) .

Колонку элюируют водой с темперао, турои +20 С(при этом также охлаждают колонку через оболочку) и собирают вытекающий из колонки раствор.

Первые 3-5 л раствора отбрасывают.

Последующие 3-5 л раствора нейтрализуют раствором едкого натра и упаривают при пониженном давлении.

Целевой продукт из полученного концентрированного раствора осаждают ацетоном. Суспензию охлаждают до о

+4 С и оставляют до полного оседания осадка. Затем осадок фильтруют и сушат.

Получают )7,5 г дигидрата динатриЭ евой соли уридин-5-монофосфорной кислоты. Чистота. 96Х. Выход. 80Х.

Таким образом., предлагаемый-способ позволяет упростить процесс

/ выделения нуклеозид-5-монофосфорных кислот, исключив стадии гидролиза, отделения неорганических примесей, нейтрализацию элюата и выделения свободных кислот из их солей, при сохранении высокого выхода и чистоты целевых продуктов.