Способ определения ди-п-метокситритил- @ - ацилдезоксирибонуклеозидов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИ-П-МЕТОКСИТРИТИЛ-N -АЦИПДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕО|ЗИДОВ с использованием раздельного определения основания нуклеозида и диП-метокситритнльных групп в среде органического растворителя, отличающийся тем, что, с целью повьшения точности и упрощения способа, проводят раздельное определение основания нуклеозида и ди-гт-метркситритильных групп дифференцированным потенхщометрнческим неводным титрованием в среде нитрометана хлорнойг или хлористоводородной кислотой, причем после оттитровывания основания нуклеозида в анализируемый раствор добавляют органическую кислоту или хлорид тяжелого металла.

СОЮЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

6% (И) II С 01 N 31/16

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

13

К ABTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

4 ф/ лгътгъ

3 (21) 3599393/23-04 (22) 01. 06. 83 (46) 07.01.85. Бюл. Р 1 (72) Б.А.Спинце, А.Я.Веверис, И.А.Хейдемане и К.И.Зиемелис (53) 543.24(088.8) (56) $. Веверис А.Я., Спинце Б.А. и Смолова Н Т, Дифференцированное ацидометрическое определение компонентов нуклеиновых кислот, их производных и смесей в среде метилцеллозольва — ЖАХ, 36, 1981, У 11, с. 2231-2235.

2. Карлиня В.А., Янсон Э.Ю., Бирска И.А. и Веверис А.Я. Спектрофотометрическое определение 2-дезок( сирибонуклеозидов по цветной реак/ ции 2 -дезоксирибозы с дифениламином - "Известия AH Латвийской CCP" сер. хим., 1983, 9 1, с. 122-123.

3. Schaller Н., Meimanng., Zerch В, Khorana Н., g., Studies on polynucleotides, XXIV The Stepwise synthesis of specific deoxyzibo-polynucleotides. Protected derivatives of deoxyribonucleotides and new synthesis

of deoxyribonucleoside-3 -phosphatesr

J. Аш, Chem Soc., 1963, ч. 85, р. 23 (прототип) . (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИ-/1-Ж-.

ТОКСИТРИТИЛ-11 — АЦИЛДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОI

ЗИДОВ с использованием раздельного определения основания нуклеозида и диП-метокситритильных групп в среде органического растворителя, о т л и— ч а ю щ и и с- я тем, что, с целью повьппения точности и упрощения способа, проводят раздельное определение основания нуклеозида и ди-/1-метокситритильных групп дифференцированным потенциометрическим неводным титрованием в среде нитрометана хлорной или хлористоводородной кислотой, причем после оттитровывания основания нуклеозида в анализируемый раствор Е добавляют органическую кислоту или хлорид тяжелого металла.

1133550

Изобретение относится к количественному определению ди-П-метокси, тритил-Н-ацилдезоксирибонуклеозидов, которые являются исходными соединениями для синтеза олигонуклеотидов и представляют актуальное значе-. ние в генной инженерии.

Для оценки пригодности препаратов для дальнейших синтезов полинуклеотидов необходимо охарактеризовать их как по основанию нуклеознда, так и ,по количеству ди-П-метокситритильных трупп.

Известен метод потенциометрическо.. го титрования пиримидиновых и lIJ- 15 риновых оснований в метилцеллозольве )1) .

Иетод имеет ограниченное применение для анализа 8 --ацилдезоксирибонуклеозидов вследствие слабо выражен- рб ных основных свойств последних в метилцеллозольве,. Иетилцеллоэольв также неприменим для проведения титрования ди-П-метокситритильных групп.

Известен метод спектрофотометри- 25 ческого определения дезоксирибонуклеозидов по цветной реакции дезоксирибозы с дифениламином (2) .

Недостатком указанного метода является то, что он дает характеристи- 3О ку анализируемого вещества только по дезоксирибозной части молекулы.

Наиболее близким по достигаемому результату к предлагаемому является спектрофотометрический способ количественного определения ди-П-метокситритил-N-ацилдеэоксирибонуклеозидов йутем раздельного определения основания нуклеозида и ди-fl-метокситритильных групп.Для определения основа- 4О ния нуклеозида навеску вещества растворяют в этиловом или метиловом спирте и измеряют оптическую плотность раствора в УФ-области спектра.

Для определения содержания ди-П-ме45 токситритильных групп .навеску растворяют в смеси этанола с 70Х-ной хлорной кислотой (при объемных соотношениях 1:1) и измеряют оптическую .3 плотность при 500 нм. Количество определяемых групп находят по калибровочному графику (31 .

Недостатками способа являются низкая точность, трудоемкость и дли1

55 тельность анализа.

Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что, провоцят раздельное определение основания нуклеоэида и ди-П-метокснтритильных групп дифференпированннм потенциометрическим неводным титрованием в среде нитрометана хлорной или хлористоводородной кислотой, причем после оттитровывания осно- вания нуклеозида в анализируемый раствор добавляют органическую кислоту или хлорид тяжелого металла.

Упрощение процесса и сокращение его длительности достигается дифференцированным потенциометрическим титрованием основания нуклеозида и ди-fl-метокситритильных групп. Это позволяет определить оба компонента в одной навеске образца. В среде нитрометана основания ди-П-метокситритил-1-ацилдезоксирибонуклеозидов проявляют довольно вьфаженные основные свойства и титруются неводным раствором сильной кислоты. Ди-П-метокситритильные группы в нитрометане основных свойств не проявляют, однако после добавления к раствору бензойной кислоты, уксусной кислоты или солей тяжелых металлов эт. группы титруются с довольно выраженным скачком потенциала. По-видимому, в присутствии названных веществ происходит разложение ди-П-метокситритилМ-ацнлдезоксирибонуклеозидов с образованием ди-р-метокситритилкарбинола, который в данной среде под деиствием этих соединений проявляет основные свойства. Использование других органических растворителей, применяемых для дифференцированного потенциометрического титрования очень слабых органических оснований, например ацетона, метилэтилкетона и . ацетонитрила-позволяет провести тит) рование основания нуклеозида, но не дает возможности осуществить потенциометрическое определение ди-tl-метокситритильных групп.

Для обеспечения дифференцированного потенциометрического титрования: основания нуклеозида и ди-П-метокситритильных групп органическую кислоту или хлорид тяжелого металла вводят только после оттитрования основания нуклеозида, так как добавление реагента в начале титрования приводит к нивелированию основных свойств определяемых компонентов и их совместному титрованию. 11335

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску анализируемого вещества 710 мг растворяют в 5-10 мл очищенного нитрометана, в раствор погружают пару электродов (стеклянный и каломельный) и потенциометрически титруют из бюретки емкостью 2,5 мл 0,02О, 03 н, неводным раствором хлорной или хлористоводородной кислоты до 10 появления скачка потенциала на кривой титрования. Затем в раствор вводят приблизительно 0,01 -О, 1 г орга- . нической кислоты или хлорида тяжелого металла, перемешивают 1-2 мин .и продолжают титрование до появления второго скачка потенциала на кривой. Первый скачок потенциала соответствует оттитрованию основания нуклеозида, а второй — оттитрованию 20 ди -ff метокситритильных групп. При анализе чистого образца объемы титранта на титрование каждого компонента одинаковы. Различия объемов израсходованного титранта на титра- 25 вание основания нуклеозида и ди-tlметокситритильных групп свидетельствует о несоответствии качества тре-, бованиям однородного препарата. Например, если на титрование основания нуклеозида израсходовано больше титранта, чем на титрование ди-и-метокситритильньм групп, образец содержит свободный нуклеозид и, следовательно,.препарат не может быть применен для синтеза олигонуклеозидов.

50 4 бинола. По данным титрования рассчитывают либо содержание основания нуклеозида и тритилгрупп, либо содержание основного вещества. Рассчитывают содержание ди-л метокситритилИ -бензоилдезоксицитидина

О 466 ° О 0215 ° 634

Х вЂ” — — — — — — — — —, 100=85, 4Х

7, 435

0 469 ° 0,0215 634

7,435

Пример 2. Количественное определение ди-»1- метокситритил-М-изобутирилдезоксигуанозина, 8,516 мг ди-и-метокситритил-Низобутирилдезоксигуанозина растворяют в 10 мл нитрометана и потенциометрически титруют 0,0289 н,раствором хлористоводородной кислоты в ацетонит.риле до появления скачка потенциала

»на кривой титрования. Затем к раствору добавляют О, 1 г уксусной кислоты, перемешивают 1 мин и продолжают титрование до появления второго скачка потенциала на кривой. На титрование основания нуклеозида израсходовано 0,419 мл (V») титранта, а на титрование ди-л метокситритильных групп 0,452 мл (Ч() . Как видно, Y»аЧ, что свидетельствует о наличии примеси ди-tl-метокситритилкарбинола. Поэ,тому для расчета содержания ди-ttметокситритил-ф- изобутирилдезоксигуанозина используют Ч, Пример 1. Количественное определение ди-tl-метокситритил-М-бензоилдезоксицитидина.

7 435 мг ди-и-метокситритил-Н- 40

) бенэоилдеэоксицитидина растворяют в

5 мл нитрометана, в раствор погружают пару электродов (стеклянный и каломельный) и потенциометрически титруют 0,0215 н.раствором хлорово- 4> дородной кислоты в диоксане до появления скачка потенциала на кривой титрования, затем к раствору добавляют 0,01 r хлорида цинка, перемещивают

2 мин и продолжают титрование до появления второго скачка потенциала.

На титрование основания нуклеозида .израсходовано 0,466 мл (V» ) титранта, а на титрование ди-»1-метокситритильных групп 0,468 мл (y ).. Поскольку N

Ч» " V, можно считать, что препарат не содержит свободного " -ацилдезокси, нуклеозида и ди-11-метокситритилкарХ О 4t9 ° 0,0289 653 ° 100 = 92,8Ж

8,516

Содержание примесей ди-»1-метокситритилкарбинола рассчитывают по разнице V» и V (О 452-0 419) ° О 0289 320 008,516

3,6Х, Пример 3. Количественное определение ди-11-метокситритил-Н-бензоил-2 -дезоксиаденозина.

9,885 мг ди-tl-метокситритил-NI бензоил-2 -дезоксиаденозина растворяют в 8 мл нитрометана и лотенциометрически титруют 0,0258 н.раствором хлорной кислоты в диоксане до появления скачка потенциала на кривой титрования. Затем к раствору добавляют

О,t г бензойной кислоты, перемеши1133550

Од463» Од0258 ° 657 00 79 47

9,885

0,420 0 0241 ° 657

Х 7 532 ° 100:= 88,3Ж

Х-(О 543 0 463) 0 0258 371 100- 7,. 20

7, 532 о

Од645- Од0229 653 О- 7

9,630

100, 1 вают 1 5 мин и продолжают титрование до появления второго скачка потенциала на кривой. На титрование основания нуклеоэида израсходовано О, 543 мл (7 ) титранта, а на титрование ди-Ц-метокситритильных групп 0,463 мп (Y ), Как видно, Yq V ч то с вид ител ьс тву е т о наличии прймеси нуклеозида. Поэтому для расчета содержания ди-и-метокси1 тритил-Й-бензоил-2 -дезоксиаденозпна 10 используют

Содержание примесей Й -безоил-2

3 дезоксиаденоэина рассчитывают по разнице и V

Пример 4. Количественное определение ди-Il-метокситритил-Н-изобутирилдезоксигуанозина.. 25

9 630 мг ди-fl-метокситритил-N1 изобутирилдеэоксигуанозина растворяют в 10 мл нитрометана и потенциометрически титруют 0,0229 н,. раствором хлорной кислоты в ацетонитриле до по-э0 явления скачка потенциала на кривой титрования. Затем к раствору добавляют 0,01 г хлорида никеля, перемешивают ъ1 мин и продолжают титро.вание до появления второго скачка по-З тенциала на кривой титрования. На титрование основания нуклеозида израсходовано 0,647 MI. (Yi ) титранта, а на титрование ди-tl-метокситритильных групп 0,650 мл (). Содержание ди-g -ìåòoêñèòðèòèë-11-из обу тнрилгуа,козина

Од640» 0 0229 ° 653

9, 630 у»

Пример 5. Количественное определение ди-Tf-метокситритил-Н-бенSO

s оилдез оксиаденоз ина.

7,532 мг анализируемого образца растворяют в 10 мл нитрометана и потенциометрически титруют 0,0241 н, раствором хлорной кислоты н диоксане до появления скачка потенциала на кривой титрования. Затем к раствору добавляют 0,01 г хлорида кобальта, перемешивают л 1 мин и продолжают титров ание до появления в торог о ск ач— ка потенциала на кривой титрования, На титрование основания нуклеозида израсходовано 0,420 мл титранта (91), а на титрование ди-П-метокситрнтильных. групп 0,422 мл () . Содержание ди-f1-метокси-Й-бензоилдезоксиаденозина

В таблице приведены сравнительные метрологические характеристики предлагаемого и известного способов определения ди-и-метокситритил-0-ацилдезоксирибонуклеозидов.

Таким образом, предлагаемый способ точнее, значительно проще в сравнении с известным сокращена длитель2 ность. По известному способу необходимо проводить два параллельных определения, причем для определения дип -метокситритильных групп необходимо строить калибровочный график, поэтому определение занимает 1,52 ч рабочего времени и требует нали- чия стандартного вещества в виде чистого препарата ди-и-метокситритилМ- ацилдезоксинуклеозида. Определение по предлагаемому способу занимает всего 15-20 мин и не требует применения в качестве стандартных веществ препаратов тритилдезоксинуклеозидов. Кроме того, способ позволяет проводить анализы в микромасштабе, поэтому на анализ расходуется несколько миллиграммов дорогостоящего анализируемого вещества.

1133550

1 Известный способ

Предлагаемый способ

Показатели

Определение нуклеозида

Определение ди-fl-метокситритилгрупп

Определение кукле озида

Допустимое расхоздение мелду 5 параллельными результатами, Х

1,2

2,1

1,5

Среднее квадратичное . отклонение результата измерения, Х

0,75

0 18

0,20,О, 15

Доверительные границы случайной погрешности при Р 0,95, Х

1,61

0,51

0,33

0,39

2,9

0,4

0,4

Систематическая погреш-ность проведения анализа, Ж

3 5

0,9

0,6

2 7

Суммарная систематичес" кая погрешность, Х

4,4

3,5

1,0

0,8

Составитель В.Шкнлькова

Редактор В.Петраш Техред Л.Иикеш Корректор Н. Король

Заказ 9945/38 Тираа 898 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Унгород, ул. Проектная, 4

Систематическая погрешность стандартизации титранта (предлагаемый способ) ипи построения калибровочного графика (известный способ) Определение ди-Cl-метокситритилгрупп