Способ получения антибиотика

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА общей.формулы СН СНгС ОН оЧ)-оя где Q - (-СНО), его . ацильного эфирного производного , сложного эфира и/или производного , где Q - (-CHjOH), заключающийся i в том, что штамм Streptomyces f radiae NRRL 12171 культивируют в питатель (Л ной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим выделением целевого продукта в виде основания и при необходимости переводом его в соль и/или ацильное эфирное производное, и/или сложный эфир, и/или производное, где Q - (CHjOH).° 00 4

СО2ОЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТКИ ЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

092 022.4 (51) С 12 Р 1/06

L

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY

-РВ

ГОСУДАРСТВЕККЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 0THPblYHA (21) 3345999/25-13 (22) 09.06.81 (31) 156.855 .(32) 12. 06.80 (33) США (46) 07.01.85. Бюп. 22 (72) Ричард Генри Балтц, Джеи Иериел

Вилд (США), Юджин Томас Сено (Вели-. кобритания) и Герберт Эндрю Керст (США) (71) Эли Лилли энд Компани (США) (53) 615.45:615.5(088.8) (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА общей формулы

0 где Q — (-СНО), его . ацильного эфирного производного, сложного эфира и/или производного, где Q — (-СН ОН), заключающийся

O в том, что штамм Streptomyces Егай2.ае 29

NRRL 12171 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных азробных условиях с последующим выделением целевого продук- Я та в виде основания и при необходимости переводом его в соль и/или ацильное эфирное производное, и/или сложный эфир, и/или производное, где

Q (СН ОН) .

СН

СН3 С

СНз .ОН Б

g-СН СНЗ

О

СНЗ где Q — (-СНО), его ацильного эфирного производного, сложного эфира и/или производного, где Q — (-СН ОН), штамм Streptomyces

fradiae NRRL 12171 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим выделением целевого продукта в виде основания и при необходимости переводом его в соль

30 и/или ацнльное эфирное производное, и/или сложный эфир, и/или производное, где Q — (СН ОН) .

Для осуществления способа используют штамм Streptomyces fradiae

NRRL 12171, который хранится в коллекции штаммов Северного регионального исследовательского центра отдела сельскохозяйственных исследований под номером ЯКИ 12171 и характеризуется. следующими приз наками.

Культурально-морфологические признаки.

На агаре Чапека спороносцы имеют изгибы, петли и неправильные короткие спирали небольшого диаметра. 45

Поверхность спор гладкая, сферической формы диаметром 0,61-0,7 1 мкм.

Воздушный мицелий слабо развит, с окраскоф от белого до серого, чаще отсутствует. Обратная сторона колоний имеет окраску от светло-желтого до умеренно желтого, Меланоидного пйгмента не образует.

Бульон с триптон-дрожжевым экстрактом (ISP-2). Рост средний, обрат- 5 ная сторона колоний желтого цвета, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

1 1134

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового антибиотика.

Аналогов в патентной и научнотехнической литературе не обнаружено.

Целью изобретения является получение нового антибиотика.

Эта цель достигается тем, что при способе получения антибиотика общей формулы !О

Проявляет антагонистическую активность в отношении ряда грамм-положительньи патогенных бактерий и вида

Mycoplasma.

Пример 1. Лиофилизированную культуру Str. fradiae NRRL 12171 диспергируют в 1-2 мп стерильной воды. Часть этого раствора (0,5 мп) используют для инокуляции 150 мл посевной среды следующего состава, 7:

Зерновая настойка 1 0

Экстракт дрожжей 0 5

Мука грубого помола соевых бобов

Карбонат кальция

Соевое масло (неочищенное)

Обессоленная вода

0 5

0,3

0,45

97,25

120 2

Среда ISP-4. Рост хороший. Обратная сторона колонии желтая, воздушный мицелий хороший, белого цвета.

Растворимый пигмент отсутствует.

Среда ISP-5. Рост хороший. Обратная сторона колонии желтого цвета, воздушный мицелий — следы, серый, растворимый пигмент отсутствует.

Среда ISP-7. Рост хороший. Обратная сторона колоний желтая, воздушный мицелий хороший, серый, Растворимый пигмент светло-коричневый.

Са-малат. Рост плохой. Обратная сторона колонии белая. Воздушныймицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Среда Чапека. Рост хороший. Обрат— ная сторона колонии желтого цвета, воздушный мицелий хороший, белый.

Растворимый пигмент отсутствует.

Томатная паста — овсяная мука.

Рост хороший. Обратная сторона колоний желтая. Воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Физиолого-биохимические свойства.

Диапазон рН для роста 6,1-7,8, температура 10-37 С. Устойчив к хлориду натрия в концентрации 47.

Усваивает глюкозу, D-фруктозу, D-галактозу, иэоинозит, сахарозу, D-ксилозу; не усваивает<а -арабинозу, D-маннит, раффинозу, салицин, D-рамнозу.

Жепатину не разжижает, молоко не сбраживает, крахмал гидролизует, нитраты в нитриды восстанавливает.

Каталаэа положительная, .фосфатаэа положительная, уреаза отрицательная.

1134120

0,0945

3

Другой вариант йриготовления посевного материала заключается в следующем.

Культуру, сохраняемую в количестве 1 мл в жидком азоте, быстро оттаивают и инкубируют в посевную среду.

Среду выдерживают в 500 миллилитроо вых колбах Эрленмейера при 29 С в течение 48 ч в закрытой трясучке при

300 об/мин.

Выдержанную посевную среду (0,5 мл) инокулируют 7 мл ферментационной среды следующего состава, Ж:

Свекольная патока 2,0

Зерновая мука 1,5

Рыбная мука 0,9

Пшеничная клейковина 0,9

Хлсрид натрия 0,1 (НН ) НР04 0,04

Карбонат кальция О, 2

Соевое масло (неочищенное) 3,0

Обессоленная вода 91,36

Инокулированную ферментационную среду инкубируют в 50-миллилитровых бутылках при 29 С в течение 6 дн на

0 закрытой трясучке при 300 об/мин.

Пример 2. Для получения большого объема инокумента берут

60 мл вццержанной посевной среды, инокулируют ее в 38 мл среды, содержащей, Ж:

Зерновая настойка 1,0

Соевая масляная мука 0,5

Дрожжевой экстракт 0,5

Карбонат кальция 0,3

Соевое масцо (неочищенное) 0,5

Лецитин (неочищенный) - 0,015

Вода 97, 185

РН среды доводят до 8,5 добавлением 50Х-ного раствора NaOH.

Эту среду инкубируют в. 68-литровок ферментере в течение 47 ч при

29 С.

4 л подготовленного таким образом посевного материала используют для инокуляции 40 л стерильной ферментационной среды следующего состава, 7:

Рыбная мука 0,9188

Зерновая мука 1,575

Зерновая клейковина О, 9188

Карбонат кальция О, 210

Хлорид натрия О, 105 (NH>) НРО4 0,042

Свекольная патока 2 10

Соевое масло (сырое) 3,15

Лецитин

Вода 90, 8859

РН регулируют до 7,2 добавлением 50K — ного раствора NaOH.

Ферментацию ведут в 68-литровом ферментере в течение 5 дн при 28 С при аэрации стерильным воздухом, при этом концентрация растворенного кислорода поддерживается в пре10 Делах 30-50Х, перемешивание осуществляют со скоростью мешалки 300 об/мин.

Пример -3. Полученную культуральную жидкость с РН 7,2 фильтруют через фильтровальный мелкозер15 нистый порошок. К 1450 мл фильтрата добавляют 400 мл этилацетата, РН раствора устанавливают 9,1 с помощью

NaOH. Смесь перемешивают 10 мин и отделяют этилацетат. Фильтрат повтор20 но экстрагируют 200 мл этилацетата.

К объединенным этилацетатным экстрактам добавляют 200 мл воды и устанавливают РН 4,1 фосфорной кислотой.

Водную фазу отделяют, а органическую

25 фазу отбрасывают, РН водной фазы доводят до 9, 1 NaOH и концентрируют . до 100 мл в вакууме. Получают аморфный осадок, выдерживают его в течение 8 ч и отделяют фильтрованием.

50 Осадок растворяют в ацетоне (20 wz) и добавляют 75 мл воды. Раствор концентрируют в вакууме, образующийся осадок отфильтровывают и промывают водой. Получают 50 мг 23-де(мицинозилокси)тилозина (ДМОТ) . Аналогичным способом из фильтрата получают дополнительно 260 мг ДМОТ.

ДМОТ представляет собой белое аморфное вещество, размягчается при 158 С, плавится при 165-167 С.

Элементный анализ,й: углерод 62, водород 8, азот 2, кислород 27.

ЭмпиРическая фоРмУла: С 8 Н6 НО

Молекулярный вес 726 (725 по данным масс-спектрометрии) .

ИК-спектр поглощения в хлороформе (шах поглощения), см ". 3653 (маленькая), 3588 (с уступом), 3470 (широкая), 3026 (с уступом), 2998 (с уступом), 2969. (интенсивная), 2932 (йнтенснвная), 2873 (с уступом), 1709 (интенсивная), 1669 (средняя), 1616 (очень маленькая), 1583 (интен- сивная), 1447 (средняя), 1400 (средняя),1365 (средняя),1309 (средняя), 1278 (маленькая), 1175 (средняя), 1151 (средняя), 1106 (маленькая), 1066 (с уступом),1036 (интенсивная).,1001 (сред120 б

1134

0,13

СБу

СН3

QH

СЦ . 55

S няя),982 (средняя),972 (с уступом), 946 (маленькая),913 (очень маленькая), 891 (очень маленькая), 853 (очень маленькая), 826 (маленькая).

УФ-спектр поглощения в нейтральном этаноле имеет максимум поглощения при

283 нмо(E 21500).

Удельное вращение/а / 62,75

Электрометрическое титрование в

66%-ном водном диметилформамиде ука- 10 зывает на наличие титруемых групп с рК величиной примерно 7,3.

Умеренно растворимо в воде, растворимо в ацетоне, метаноле, диметилформамиде, хлороформе,диметилсульфокси- 15 де и других полярных органических растворителях. Лучшей растворимостью в воде обладают соли, кислот.

Антимнкробная активность, мкг/мп:

Streptococcus pyogeneg 20

С 203 0,25

Streptococcus pneumoniae р 1

Streptococcus (группа D) 282 Ь,5 25

Staphylococcus

aureus 3055 1,0

Pa s teurel la mu1 toc ida 6, 25

Pas teur el la hemoly t ica 25, ОС

Nyc op 1 asma gal 1 i sep30

ticum 0,097

Nycoplasma hyopheumoniae 0,39

Mycoplasma hyorhinis 0,79

Пример 4. 11 r ДМОТ растворяют в разбавленной соляной кислоте (pH 1, 8). Полученный раствор выдер— живают при комнатной температуре в течение 24 ч и затем рН доводят до

9,0 с помощью NaOH. Щелочной раствор экстрагируют хлороформом Полученный 4р экстракт сушат в вакууме и получают

9,65 г 23-деокси-5-О-мицаминозилтинолида (ДОМТ), имеющего структурную формулу

Пример 5. 50 мг ДМОТ растворяют в водном растворе изопропиловоro спирта (40%, 25 мл) . В 30%-ном водном растворе изопропилового спирта (10 мп) растворяют 20 мп борогидрида натрия. 1 мл борогидрида натрия добавляют к раствору, содержащему

ДМОТ. Полученную смесь перемешивают в течение 5 мин. Устанавливают Рн

7,5 с помощью фосфорной кислоты и концентрируют в вакууме. Добавляют

50 мп хлороформа. рН регулируют до

7,5. После экстракции отделяют хлороформ и выпаривают досуха. Получают 20-дигидро-23-де(мицинозилокси)тилозин (дигидро-ДМОТ) .

Дигидро-ДМОТ можно перевести в дигидро-ДОМТ, используя метод, описанный в примере 4.

Пример 6. Получение 2 О-ацетил-ДМОТ.

5,0 r (6,,9 моль) ДМОТ растворяют в 150 мп и обрабатывают 0,84 мл (8,2 ммоль) уксусного ангидрида, добавляемого по каплям при перемешивании и при комнатной температуре.

После перемешивания в течение 17 ч растворитель выпаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в малом объеме этилацетата и хроматографируют на силикагеле. Элюируют 4 л этилацетата. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении. Получают 4,2 г (80%) 2 -Оц

-4- ацетил-ДМОТ. г

Пример ?. Получение 2-0Ф

-ацетил-4-финилацетил-ДМОТ.

2,7 г (3 „5 ммоль) 2-О-ацетил-ДМОТ растворяют в 70 мл хлористого ме-. тилена и 0,8 мл пиридина и обрабатывают раствором 0,56 мп (3,5 ммоль) фенилацетилхлорида в 30 мл хлористого метилена при перемешивании и при комнатной температуре. Через 6 ч растворитель выпаривают, остаток растворяют B хлористом метилене и экстрагирувт насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают.

Остаток растворяют в этилацетате и хроматографируют на силикагеле (Вотерс Преп 500). Колонку элюируют

4 л зтилацетата. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и выпаривают досуха. Получают 1,2 г (3%) .2-0-ацетил-4-0-фенилацетил-ДМОТ.

lf

Пример 8. Получение 2-0-аце-, h тил-4-0-из овал ерил-ДМОТ.

11

1>2 г (1.6 ммоль) 2 -0-апетил-ПМОТ в 29 мл лилианна обрабатывают 0,7 мл (3,9 ммоль) изовалерилхлорида при перемешиванни при 0 С. После обработки сухой продукт растворяют в толуоле н хроматографируют на силикагеле. Колонку элюируют смесью толуола и этилацетата (9: 1 до 1:2). Получают 0,12 r продукта. Затем элкируют колонку хлористым метиленом и получают 0,84 г (55Х) 2-0-ацетил-4

1 Ч

-О-фе нила цетил-ДМОТ. Ю

Пример 9. 4-0-Изовалерил-ДМОТ.

0,4 r 2-0-ацетил-4-0-изовалерил-ДМОТ растворяют в 30 мл 80Х-ного водного метанола и кипятят в течение 4,5 ч.,Раствор охлаждают .до комнатной температуры и выпаривают досуха при пониженном давлении. Получают 0,13 г (34X) целевого продукта.

/I

10. 4-0-ФенилацетилСоставитель Г. Смирнова

Редактор И.Николайчук Техред А.Бабинец Корректор В. Синицкая

° В

Заказ 9972/46 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример

-nM0TI

0,2 r 2-0-ацетил-4-0-фенилацетил-ДМОТ растворяют s 18 мл 80Х-ного водного метанола и кипятят в течение

5 ч. Раствор охлаждают до комнатной температуры и выпаривают досуха при пониженном давлении. Получают 0,16 г (86Х) 4-0-фенилацетил-ДМОТ.

34120 8

П р н м е р 11. Получение 2-0r

-ацетнл-4-пр опионнл-ДМОТ.

В 30 мл пиридина растворяют 1 r

2-0-ацетил-ДМОТ н обрабатывают

5 раствор 0,6 мл пропионового ангидрида, добавляемого по каплям при перемешивании прн комнатной температуре.

Через 20 ч добавляют еще 3,0 мл пропионового ангидрида и реакционную массу перемешивают в течение 26 ч при комнатной температуре. Смесь разбавляют 30 мл толуола и при пониженном давлении выпаривают растворителем. Остаточное масло растворяют в

15 50 мл дихлорметана и экстрагируют насъщенным раствором бикарбоната натрия.

Органический слой отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают. Остаток загружают в колонку с .20 силикагелем и элкируют при линейном градиенте толуола (4 л) и этилацетата (4 л). Элкируют 305 мг 2-0-ацетил3,4-ди-О-пропионил-ДИОТ, а затем

Ф

286 мг 2-0-ацетил-4-0-пр опионил-ДМОТ.

Каждое соединение кипятят с обратным холодильником в 80Х-ном водном метаноле и получают два производных

ДМОТ.

Использование изобретения позво30 ляет расиирить ассортимент антибактериальных средств.