Способ выделения гликозаминогликанов из лейкоцитов крови

 

СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ путем экстракции липидов органическими растворителями, обработки протеолитическими ферментами, оСаждения балластных белков с последующей обработкой продукта четвертичноаммонийными основаниями и этанолом, о тл и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, упрощения и ускорения способа , экстракцию липидов проводят ацетоном, протеолитическое расщепление - папаином в присутствии ЭДТА и цистеина, целевой продукт получают дифференциальной экстракцией растворами солей возрастающей ионной силы. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

5 1М

РЕСПУБЛИК (l9) (11) 4(s() А 61 К 35/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ1Ф

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,(21) 3560974/28-13 (22) 11.01.83 (46) 23,02.85. Бюл. йъ 7. (72) М.Ф. Харченко, Т.Л, Шатская, С.С. Остроумова и Г.Я. Гдалевский (71) Ленинградский ордена Трудового

Красного Знамени и ордена Дружбы народов научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (53) 612.015. 1(088.8) (56) 1.: Murata К. Biochemica1 Medi-.

cine, 1980, 23, 324-335 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗА-

ИИНОГЛИКАНОВ ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ путем экстракции липидов органическими растворителями, обработки про:теолитическими ферментами, осаждения балластных белков с последующей .обработКой продукта четвертичноаммонийными основаниями и этанолом, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, упрощения и ускорения способа, экстракцню липидов проводят ацетоном, протеолитическое расщепление — папаином в присутствии

ЭДТА и цистеина, целевой п .одукт получают дифференциальной экстракцией растворамй солей возрастающей ионной силы.

f 1140787 2

Изобретение относится к клинической биохимии и касается способа выделения гликозаминогликанов (ГАГ) из лейкоцитов человека.

Известен способ выделения ГАГ из лейкоцитов, включающий термоденатурацию лейкоцитов, экстрагинирование липидов этанолом и эфиром, переваривание проназой при 55, обработку щелочью, отделение белков и. ну- 10 клеиновых кислот трихлоруксусной кислотой, диализ для освобождения от низкомолекулярных примечей и осаждение конечного продукта цетилпиридинхлоридом с последующим переосаж- 15 дением этиловым спиртом, насыщенным ацетатом натрия (13.

Однако полученные указанным методом ГАГ характеризуются гетерогенностью, что затрудняет исследование 20 их состава в клетках крови и изучение свойств отдельных видов ГАГ.

Кроме того, известный метод не экономичен, как в силу длительности всей процедуры (13-14 дней), так и 25 из-за применения дорогого импортного фермента (проназы).

Цель изобретения — повышение. чистоты .препарата гликозаминогликанов, упрощение и ускорение способа его 30 выделения. !

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения гликозаминогликанов из лейкоцитов крови путем экстракции линидов opra- 35 ническими растворителями, .обработки протеолитическими ферментами, осаждения балластных белков с последующей обработкой продукта четвертичноам- монийными основаниями и этанолом 40 экстракцию липидов проводят ацето-. ном, протеолитическое расщепление— папаином в присутствии ЭДТА и цистеина, целевой продукт получают дифференциальной экстракцией раство- 45 рами солей возрастающей ионной силы.

Способ осуществляется следующим образом.

Лейкоциты крови, выделенные дифференциальным центрифугированием, 50 обрабатывают двукратно 10-15 объема" ми ацетона, фильтруют на воронке

Бюхнера и высушивают на воздухе.

Полученный сухой порошок растирают при помощи гомогенизатора с фермент- 55 но-буферной смесью, содержащей кристаллический папаин (2 мг на .100 мг сухого порошка), 5 мМ цистена и

4 мИ ЗДТА а в 0,05 M фосфатном буфере, рН 7,5. Ферментно-буферная смесь берется из расчета 10 мл на

100 мг высушенных клеток. Суспензию клеток переносят в небольшие флаконы и инкубируют при 65 С в ультратермостате в течение 4 ч. После окончат ния переваривания к полученному лизату добавляют 50Х-ную трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5Х, и в течение ночи при 4-6 C происходит осаждение белков и нуклеиновых кислот. Осадок удаляют центрифугированием при 3000 об/мин при 0 С, К супернатанту при интенсивном перемешивании добавляют 4 объема охлажденного до 0-(-5 ) 96Х- ного этанола и 50Х-ного раствора ацетата до конечной концентрации 0,5Х. Оставляют для формирования осадка при

0-4 С в течение 18-24 ч. Сформировавшийся хлопьевидный осадок, представляющий собой ГАГ в смеси с гликогеном и другими высокомолекулярными соединениями, отделяют. центрифугированием при 3000 об./мин при 0-4 в течение 20 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде, добавляют

NaC1 до конечной концентрации не выше 0 15 М, обеспечивая полное растворение, после чего добавляют

0,2 объема 5Х-ного раствора бромистого цетилтриметиламмония (цетавлона) — "сЬешаро1" (Чехословакия).

Специфическое формирование комплек-. са ГАГ с цетавлоном происходит в течение 30-60 мин при 37 С или

8-10 ч при комнатной температуре.

Для уплотнения осадка добавляют

5-10 мг целита и отделяют комплекс ГАà — цетавлон центрифугированием. Осадок промывают 0,2 М NaC1 для удаления низкомолекулярных балластных примесей. Дифференциальную экстракцию ГАГ осуществляют поочередным добавлением к осадку небольших объемов растворов хлористого натрия в концентрации 0,5, 0,7, 1,0 и 2,0 И. Вследствие гетерогенности

ГАГ (различий их по молекулярной массе и полианионным свойствам) их комплексы с детавлоном различаются по растворимости, и при помощи дифференциальной экстракции удается выделить отдельно разные виды ГАГ.

Фракции, экстрагируемые 1М и 2М

NaC1, не различаются по составу, поэтому их объединяют. Полученные

3 фракции ГАГ переосаждают и дополнительно очищают от примесей добавлением 4 объемов охлажденного до 0 этанола с добавлением ацетата Na в конечной концентрации 0,5-1%. Осаждение очищенных ГАГ происходит в течение ночи при 0-4 С, осадки отделяют центрифугированием при

3000 об./мин в течение 20 мин. Полученные осадки ГАГ растворяют в дистиллированной воде или физрастворе, при необходимости проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры "Миллипор", хранят в замороженном или лиофилизированном состоянии. Для анализа фракций применяют электрофорез в ацетатцеллюлозе, содержание и выход ГАГ определяют по концентрации уроновых кислот, определенной карбазольным методом. Zp

Выход ГАГ в среднем составляет 110130 мкг уроновых кислот на 100 мг ацетонового порошка лейкоцитов.

Пример 1. К 280 мл донорской крови, заготовленной на консер-. ванте с цитратом натрия, добавляют

70 мл ЗХ-ного раствора пищевой желатины в физиологическом растворе хлорида натрия, после чего в течение I ч клетки крови оседают при

37 С. Верхний плазменный слой, содержащий лейкоциты и тромбоциты, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре на центрифуге К-70. Осадок

3S. лейкоцитов (1 мл) двукратно промы,вают 10 мл.физиологического раствора на центрифугер ПЛК-1 при

1000 об./мин. Для удаления примеси эритроцитов к промытому осадку добавляют 7 мл охлажденного 0,83%-ного .

NH<-CE в 0,0125 И трис-HCE буфере, . рН 7,4, затем пробу тщательно перемешивают и удаляют образовавшийся гемолизат центрифугированием на цент рифугер ЦПК-1. Осадок промывают физиологическим раствором, Выделенные клетки лейкоцитов (в объеме 0,6 мл) обрабатывают 9 мл ацетона, затем растирают в гомогенизаторе и фильтруют через воронку Бюхнера,используя вакуумный насос. Полученный порошок обезвоженных и частично обезжиренных клеток высушивают на воздухе.

1140787

Из 280 мл донорской крови получают 100 мг сухого порошка клеток.

К 100 мл сухого порошка клеток приливают 10 мл ферментно-буферной смеси, содержащий 2 мг кристаллического папаина, 8,7 мг цистеина и 18,6 мг

5 ЭДТА в 0,05 И фосфатном буфере, рН 7,5, и растирают в гомогенизаторе.

Взвесь переносят во флакон емкостью

20 мл и инкубируют в ультратермостате при 65 С в течение 4 ч. После о окончания переваривания к полученному лнзату добавляют 1,0 мл 50Х ТКУ.

Смесь оставляют на ночь в холодильнике при 4 С для осаждения белков и нуклеиновых кислот. Осадок удаляют

5 центрифугированием при 3000 об/мин при 0 С. К супернатанту при интенсивном перемешивании добавляют 40 мл

96Х-ного охлажденного этилового спирта и 0,5 мл 50Х-чого раствора ацетата Na. Оставляют до формирования осадка в течение 18 ч при 4 С

Сформировавшийся хлопьевой белый осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мнн при -2 С в течение

20 мин, супернатант отбрасывают. Осадок растворяют в 2,0 мл дистиллированной воды и добавляют 3 капли

1,0 М раствора хлорида натрия до полного растворения. К пробе добавляют 0,4 мл 5%-ного водного, раствора цетавпона; Осаждают ГАГ при 37 С в течение 1 ч. Для получения более плотного осадка добавляют 10 мг целита и проводят центрифугирование пробы при 4000 об/мин в течение

10 мин при комнатной температуре, супернатант удаляют, а осадок суспендируют в 2,0 мл 0,2 М раствора

NaCE. Дифференциальную экстракцию

ГАГ из комплекса с цетавлоном осуществляют добавление- к осадку раствора хлорида Na:1-я экстракция проводились 0,5 И NaCE (1,5 мл); 2-я экстракция — 1,0 мл 0,7 М NaCi, 3-я — 1,0 мл 1,0 И NaCR, 4-я 0,5 мл

2,0 И раствора хлорида натрия, После каждой экстракции пробу центрифугируют. Экстракты ГАГ, полученные при концентрации NaCX 1,0 и

2,0 И, объединяют. Полученные фракции ГАГ при концентрации хлорида

Ма 0,5, 0 7 и 1 + 2,0 М переосаж" дают соответственно. 6,0; 4,0 и.

6,0 мл. переохлажденного до -4 С этаиола при этом в каждую пробу и с ГАГ добавляют 3 капли 50Х-ного раствора ацетата Na. Осадки, содер.жащие очищенные ГАГ, растворяют

1140787

ВНЮШИ 3аааа 360/5

Тираж 722 Подписное

4еииал ППП "Патежй" ° rfaroyeap ул.Пpoeжтaая э 4

Э в дистиллированной воде. После определения содержания ГАГ пробы замора кивают или подвергают стерилизующей фильтрации с последующей лиофилизацией целевого продукта. 5

Выход ГАГ из лейкоцитов составляет 120 мкг уроновых кислот из 100 мг сухого порошка.

Пример 2. Вся процедура получения ГАГ проводится по примеру 1, sa исключением некоторых режимов — параметров способа. Так, например, при получении лейкоцитов осадок лейкоцитов (1,2 мл) двукратнопромывают 15 мл физиологического раствора; для удаления примеси эритроцитов к промытому осадку добавляют

10 мл охлажденного 0,83Х-ного NH40F. в 0,01?5 М трис-НСЙ буфере...Выделенные клетки лейкоцитов (0,7 мл) об- 2О рабатывают 7,0 мл ацетона. Из 280 мл донорской крови получают 105 мг сухого порошка клеток, При получении ГАГ осаждение белков и нуклеиновых кислот проводят при 6 С...После добавления охлажденного спирта и ацетата натрия осадок формируется в течение 24 ч. Осаждают ГАГ при 37 С в течение 30 мин.

Для уплотнения осадка добавляют 30

5 мг целита...

Выход ГАГ из лейкоцитов состаьпяет 115 мкг уроновых кислот иэ 100 мг сухого порошка.

П .р и м е р 3. То же самое, что в примере 1, только стадию осаждения ГАГ цетавлоном проводят при комнатной температуре в течение 10 ч.

Выход ГАГ из лейкоцитов составляет 130 мкг уроновых кислот из 100 мг 4п ацетонового порошка клеток.

Идентификацию гликозаминогликонов осуществляют следующим образом.

Анализ фракций ГАГ включает определение содержания гексазаминов, галактозаминов, уроновых кислот, сульфата и электрофоретический àíà- I лиз на ацетатцеллюлозных пленках.

Электрофорез проводят в 0,25 М

Са-ацетатном буфере, рН 5,5 при плот- о ю ности тока 0 5 Ма/см в течение 4 ч на приборе ПЭФ-3 на ацетатцеллюлозных пленках фирмы Pratiga (Италия) с перфорацией. Пробы наносят при помощи ампликатора этой же фирмы.

Окраску электрофореграмм проводят

0,5Х-ным раствором Алциан синего в ЗХ-ном растворе СН,СООН или 0,2Хным раствором толуидина в 2Х-ном

СН СООН с последующей отмывкой фона

1Х-ным раствором СН, СООН, а затем водой. В качестве стандартов ГАГ используется хондроитин-4-сульфат

"Sigma" (США), гиалуроновая кислота, полученная из стекловидного тела кролика, и гепарансульфат из печени крысы.

Электрофоретические исследования

ГАГ, выделяемых из лейкоцитов крови, свидетельствуют о том, что они представлены в основном хондроитинсульфатом, об этом также говорят данные определения гексозаминов, сульфата и уроновых кислот и их соотношение.

Тот факт, что ГАГ расщепляются тестикулярной гиалуронидазой без образования свободного ацетилгексозамина, свидетельствует о том, что ГАГ лейкоцитов представлены хондроитинсульфатом.

Предлагаемый метод выделенич ГАГ из лейкоцитов .крови позволяет значительно ускорить и упростить процедуру выделения ГАГ (сокращается время— выделения от 13-14 до 4 сут; исключается стадия диализа, сокращается время протеолиза с 2-3 сут до 4 ч и т.д.). Кроме того, в предлагаемом методе не используются дефицитные реактивы, в частности проказы.

Предлагаемый метод позволяет получить целевой продукт в более очищенном виде, об этом сзидетельствуют данные электрофоретического анализа.

Вазработанный способ выделения

ГАГ из лейкоцитов крови позволяет проводить исследования количественного содержания ГАГ, их состава в клетках крови здоровых людей и больных лейкозами.