Способ определения моноаминооксидазной активности тромбоцитов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНООКСВДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ путем инкубации солюбийизата мембран тромбоцитов бензиламином в качестве субстрата, отличающийся тем, что, с целью повышения точности cifoco6a путем определения множественных форм моноаминооксидазы, солюбилизат мембран наносят, на колонну, заполненную иг-аминогексил сефарозой -4В, далее элюируют белковую фракцию 0,1 М фосфатным буфером при рН 7,4, в полученном элюате определяют с помощью субстрата, форму моиоаминсоксидазы активностью 0,02±0,0t нмоль/мг белка в минуту, далее элюируют тем же фосфатным буфером с добдвлением тритона Х-100 в градиенте концентраций 0,001-0,25%, в полученном элюате определяют форму моноаминооксидазы активностью 1,910,2 нмоль/мг белка. в минуту, далее элюируют 0,4 М фосфатным буфером при рН 7,4 с добавле (Л нием 0,25%-ного тритона Х-100, в полученном элюате определяют форму моноаминооксидазы активностью 1j7 tOj2 нмоль/мг белка в минуту.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

4(5l1 G 01. N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ с

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

I (21) 3593276/28-13 (22) 04.04.83 (46) 23.03.85 Бюл. N 11 (72) Т.А.Москвитина, О.Н.Волошина и В.З.Горкин (71) Институт биологической и медицинской химии АИН СССР „ (53) 616.07(088.8) (56) 1. M.Sandier, T.À. Reveley;

Ч.Glover. Human platelet MAO activity in health and disease, à revion.-I.Clin. Patol, 1981, 34, р. 292-302. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ MOHOANHНООКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ путем инкубации солюбилизата мембран тромбоцитов бензиламином в качестве субстрата, отличающийся тем, что, с целью повышения точнос„„SU „„146605 А ти способа путем определения множественных форм моноаминооксидазы, солюбилизат мембран наносят. на колонну, заполненную в-аминогексил сефарозой

-4В, далее элюируют белковую фракцию

0,1 М фосфатным буфером при рН 7,4, в полученном .элюате определяют с помощью субстрата форму моиоаминооксидазы активностью 0,02т0,01 нмоль/мг белка в минуту, далее элюируют тем же фосфатным буфером с добавлением тритона Х-100 в градиенте концентра ций 0,001-0,25Х, в полученном элюате определяют форму моноаминооксидазы активностью 1,9+0,2, нмоль/мг белка в минуту, далее элюируют 0,4 М фосфатным буфером при рН 7,4 с добавлением 0,257.-ного тритона Х-100, в полученном элюате определяют форму моноаминооксидазы активностью 1 7

Ю,2 нмоль/мг белка в минуту.

Составитель С.Котеневцев

Редактор Т.Кугрышева Техред M.Кузьма . Корректор Е.Рошко

Заказ 1357/34 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, 3-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул .Проектная, 4

4 11466 г

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии имедицины,а именно .к способам определения активности фермента в организме, конкретно к способам определения моноаминооксидаэной (ИАО) активности, и может быть использовано в медицинской и лабораторной практике, а также в научных целях.

Целью изобретения является повы- 1О шение точности способа путем определения множественных форм моноамино-. оксидазы.

Пример осуществления способа.

500 мл донорской крови, содержащей

0,38Х цитрата натрия, центрифугируют при 200 С в течение 10 мин. Осадок эритроцитов промывают 0,15 И NaC1 два раза и отделяют центриф гирова- щ нием. Объединенные надосадочные жидкости центрифугируют в тех же условиях, отбрасывая осадок, надосадочную ,жидкость центрифугируют 20 мин при

650 я. Тромбоциты суспензируют в д

0,01 И К вЂ” Na фосфатном буфере при

05 3 рН 7,4. Смесь тромбоцитов центрифугируют 10 мин при 30 тыс ° g надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок гомогенизируют в стеклянном гомогени. заторе в солюбилиэирующей смеси,состоящей из 1,3 М мочевины, 1,3Ж тритона

Х-100 в 0,01 M фосфатном буфере при рН 7,4. Через 30 мин смесь центрифугируют 30 мин при 30 тыс.g, обессоливают на колонке с Сефадексом Г-50 (23 1,2 см) и концентрируют .на ультрафильтре Амикон PM-30 в 7 раз.

Раствор наносят на колонку с афинным сорбентом АН-Сефарозой 4В (13 1,2 см), промывают 0,01 И фосфатным буфером при рН 7,4; множественные формы MAO элюируют фосфатным буфером различной концентрации и градиентом концентрации тритона Х-100. Определяя белок и активность моноаминооксидазы (например, с бензиламином в качестве субстрата) в пробах, получают профиль элюции, характеризующий содержание (изоферментный состав) и величину активности трех множественных форм моноаминооксидазы.