Способ определения сульфгидрильных групп в гемсодержащих белках

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФГВДРИЛЬНЫХ ГРУПП В ГЕМСОДЕРЖАЩИХ БЕЛКАХ путем инкубации белка с реагентом и пбследукяцего спектрофотометрирования , отличающийся тем, что, с цеЛвю повьппения чувствительности и упрощения способа, в качестве реагента используют перхлорат 3,3-диметил-1-17-диметш1аминофенилфталилия , а инкубацию ведут при рН 3,0-5,5

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

4(51) G 01 Н 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Г „.:.-. .;1 Г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ев эквь - г.т юс..- .. г (21) 3634736/28-13 (22) 21 ° 06.83 (46) 30.03.85. Бюл. N - 12 (72) И.И. Степуро, Д.А. Опарин и Ю.М. Островский (71) Отдел регуляции обмена веществ

АН БССР (53) 547.96(088.8) (56) 1. Butter vorth P.Н.W., Baum Н., Porter J.W. Arch. Biochem and Biophyr. 1967, 118, р. 716.

„„su„„ а (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП В ГЕМСОДЕРЖАЩИХ БЕЛКАХ путем инкубации белка с реагентом и последующего спектрофотометрирования, отличающийся тем, что, с целью повьппения чувствительности и упрощения способа, в качестве реагента используют перхлорат 3,3-диметил-1- 1-диметиламинофенилфталилия, а инкубацию ведут при рН 5,0-5,5

1147981

ВНИИХИ Заказ 1569/37 Тираж 897 Подписное

Филиал ШШ "Патеит", t.ÓIãîðîä, ул.Проектная, 4

Изобретение относится к биохимии и ка".ается количественного определения сульфгидрильных групп в гемопротеидах и может быть .использовано для быстрого количественного определения сульфгидрильных групп, например, в гемоглобине при проведении биохимических анализов, в лабораторной медицинской практике, в генетике . при определении мутантных форм гемо- 10 глобина.

Известен способ определения сульфгидрильных групп в гемсодержащих белках путем ийкубации белка с реагентом и последующего спектрофото- 1S метрирования, основанный на спектрофотометрической регистрации продуктов взаимодействия сульфгидрильных групп с 5,5 -дитиобис(2-нитробенl зойной)кислотой (реактив Эллмана). 20

Согласно известному способу после инкубирования белка с реагентом отде-. ляют белок от избытка реагента, вос- станавливают смешанный дисульфид, отделяют белок и затем спектрофотомет- 2 рируют надосадочную жидкосгь (2) .

Однако этот способ характеризу ется недостаточной чувствительностью и является трудоемким.

Цель изобретения — повышение 30 чувствительности способа и упрощение процесса определения.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения сульфгидрильньгх гРупп в гемсодержащих белках путем инкубации белка с реагентом и последующего спектрофотометрирования в качестве реагента используют перхлорат 3,3,диметил-1-П-диметиламинофенил40 фталилия, а инкубацию ведут при !

РН 5,0-5,5.

Пример 1. Готовят исходные растворы ПДАФ (1,8 мг в 25 мл С,,=

=2 10 ) и гемоглобина лошади (34 мг 4 в 25 мл С ем =2 10 ) в фосфатном (КН,РО -Ма, НРО ) буфере с РН 5,0.

Затем к 1 мл гемоглобина добавляют

1 мл реагента и относительно полученного раствора спектрофотометрируют при 470 нм разбавленный в 2 раза буфером с РН 5,0 исходный раствор ПДАФ, Находят a2=0,21 и по формуле рассчитывают количество сульфгидрильных групп: и =1,90. и п йВ kq k (1+ — + — 1- ), ьп - 27700 Сгем + k< где g D — изменение оптической плотности

С ц — концентрация гемопротеида;

k .-. константа равновесия с учас1 тием карбониевых ионов, равная 1,15 10 — константа равновесия с учас2 тием аммониевых ионов, равная 3,19 ° 10 ан+ — активность ионов водорода в растворе.

Пример 2. Из 1 мл крови человека центрифугированием осаждают эритроциты и проводят их гемолиз в

50 мл воды известным способом. 3атем гемолизат доводят фосфатным бу-. ферным раствором с РН 5,3 до V = — 100 .мл. Готовят раствор реагента растворением 1,8 мг ПДАФ в 25 мл буфера с РН 5,3. Дальнейшее определение проводят аналогично описанному.

Находят В=0,15, и „=1,98.

Предлагаемь1й способ повьппает по сравнению с известным чувствительность определения в 2 раза за счет того, что молярный коэффициент поглощения ПДАФ (Е=27700 л.м см при

-1

470 нм) в 2 раза больше, чем у аниона 2-нитро-5"тиобензоата (6

-!

=13600 л м см при 410 нм), Упрощение определения при осуществлении предлагаемого способа обеспечивается тем, что известный способ предусматривает инкубацию с реагентом, отделение его избытка, восстановление смешанного дисульфида, осаждение белка и спектрофотометрирование надосадочной жидкости, в то время как предлагаемый способ облегчает определение за счет устранения ряда операций — отделение от избытка реагента,. восстановление смешанного дисульфида, осаждение белка, что в совокупности позволяет уменьшить время определения до 25-30 мин при исследовании каждой пробы.