Способ определения метаболитов в биологическом материале
) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРШЛЕ путем фиксации ткани, осаждения белка хлорной кислотой и спектрофотометрирования при 340 им в присутствии никотинамидного кофермекта и ферментов лактатдетидрогеназы.при определении пирувата и глутаматдегидрогеназы при определении dl-кётоглутарата, о т л и ч а ю щи и с я тем, что ,с цёI лью дополнительного определения в одной пробе малата, лактата, -глицерофосфата , -оксибутирата, глутамата , оксалоацетата, ацетоацетата, н диоксиацетонфосфата, вносят часть I нейтрализованного экстракта в глицингидразиновый буфер рН 9,5, содержащий 4, К окисленный никотинамид адениндинуклеотид и определяет малат, лактат, -глицерофосфат,глутамат и -оксибутират при последовательном добавлении соответственно малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы , dl тлицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и 0-оксибутиратдегидрогеназы , а другую часть нейтрализованного экстракта вносят в триэтаноламинсолянокислый буфер рН 7,6, содержащий 1, М восста (П новленный никoтинa шдaдeниндинyклeoТ ед , и определяют пируват, оксалоацетат , d- -кетоглутарат, диоксиацетонфосфат и ацетоацетат при последовательном добавлении соответственно лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы , глутакатдегидрогеназы, с --глиСП церофосфатдегидрогеназы и } -окси бутиратдегидрогеназы. NU ел со
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СООИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (!9) (!» .
w ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3584981/28-13 (22) 19.01 83 (46) 23.05.85. Бюл. И 19 (72) Ф.Н.Гильмиярова, В.И.Радомская и Л.Н.Виноградова (71} Куйбышевский медицинский инсти" тут им., Д.И.Ульянова (53} 581.13(088.8) (56) I. Von Korf H.N. Purity and stability of pyruvate and А -ketoglutarate in: "Methods in Knzymology" v. l3, Меч York - London, 1969, р. 519-524. (54}(57:) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЕТАБО-. ЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОИ МАТЕРИАЛЕ пу- . тем фиксации ткани, осаждения белка хлорной кислотой и спектрофотометрирования при 340 нм в присутствии никотинамидного кофермента и ферментов лактатдегидрогеназы при определении пирувата и глутаматдегидрогеназы при определении сА "кетоглутарата, о т " л и ч а ю шийся тем, что с це.,лью дополнительного определения в одной пробе малата, лактата, К -глицерофосфата, р -оксибутирата, глута" мата, оксалоацетата, ацетоацетата, к диоксиацетонфосфата, вносят часть нейтрализованного экстракта в глицннгидразиновый буфер рН 9,5, содержащий 4,5 IO Y окисленный никотин амидадениндинуклеотид и определяют малат, лактат, d. -глицерофосфат,глутамат и Р -оксибутират при последовательном добавлении соответственно малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, oI. -глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и Р -оксибутиратдегидрогеназы, а другую часть нейтрализованного экстракта вносят в триэтаноламинсолянокислый буфер рН 7,6, содержащий 1,4 10 И восста- р новленный никотинамидадениндинуклео- MФ тнд, и определяют пируват, оксалоацетат, d- -кетоглутарат, диоксиаце" тонфосфат и ацетоацетат при последовательном добавлении соответственно лактатдегидрогеназы малатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, d- -гли" церофосфатдегидрогенаэы и Р -оксибутиратдегидрогеназы. 1157459 да калия. Определение содержания малата, лактата,; -глицерофосфата,глутамата 35 и Р -оксибутирата. Состав реакционной .смеси: Буфер глицнн гидраэинсульфатный, рН 9,5,глицин 0,5 М, 40 гидраэин-сульфат 0,4 11, мл 2,8 НАД 0.,9 мг/ил, мл О,! Нейтрализованный экстракт, ил Фермент, мкг Общий объем смеси 3 мл. Длина волны 340 нм, слепой опыт не содержит кофермента. Реакция начинается последовательным внесением 50 фермента! малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, сА -глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогенаэы, и ! " -оксибутиратдегидрогеназы. Учитывается прирост оптической плотности 55 с момента ннесения соответствующего фермента до прекращения прироста и стабилизации показателей: Е - Е, со-, 0,1 45 Изобретение относится к биологии и может быть использовано в медицине для определения содержания метаболитов в биопсийном материале тканей при оперативных вмешательствах, а 5 также в условиях эксперимента на животных для характеристики специфики обмена каждой ткани в норме в качестве диагностических и прогностических тестов при патологических состояниях,10 Цель изобретения — дополнительное определение. н одной пробе малата, лактата, А -глицерофосфата, (> -оксибутирата, глутамата, оксалоацетата, ацетоацетата и диоксиацетонфосфата, 15 Пример. Биопсийный материал (например, печень) после взятия эали" вают жидким азотом, навеску в 200иг гоиогенизируют до получения однородной порошкообраэной массы, подливая жидкий азот. Порошок запивают 0,4мл 0 6 н. раствора HCl0, тщательно растирают при комнатной температуре и оставляют для экстракции на 20мин. По истечении времени центрифугируют 25 при 600 д 15 мин. Кислый супернатант сливают, осадок денатуриэованногo бел— ка отбрасывают. По универсальному индикатору нейтрализуют 2 и, КОН 0,6 ил. Помещают в ледяную баню на 5 иин и центрифугируют при 600 д 5 мин для освобождения от гипахлоритяии; К вЂ” коэффициент раз недения; 3 — объем реакционной сиеси; 6,22 — коэффициент микромолярной экстинции НАД. Н при 340 нм ! см /мкмоль) . Приведенная формула является однотипной дпя расчета содержания определяемых метаболитов и коферментов в микромолях на 1 г ткани. Определение мапата. Вносят малатдегидрогенаэу Еа 0,067 0„100 02 Е, 0,1 йЕ 0,0 С = 0,545 Определение лактата. Вно сят лакт атде гидро ген азу Ео 0,)15 0,145 0,170 0,195 0,260 0,300 0,320 0,340 0,370 0.415 Е 0,415 Е = Ов300 и 0 = 4,38. Определение с! -глицерофосфата. Вносят.1 †глицерофосфатдегидрогенаэу (! Ео 0,320 0,340 0,352 0,370 0,375 0,382 0,385 0,385 0,065 Е ЛЕ= С = 1,013 Определение глутамата. Вносят глутаматдегидрогеназу Ео О, 395 0.415 ответствует содержанию малата в пробе; Е -Е, лактата; Е, -Е, с . -глицерофосфата; Е - Е, " глутамата; E>-Ep & -оксибутирата, Концентрация метабо.метов выражается в микромолях на r ткани, Расчет ведут по формуле AE ° 3 6,22 K где Д Е вЂ” разница между конечной и начальной оптическими плотнос1157459 0,430 0,455 0,460 0,470 0,475 0,475 0,080 0,485 0,500 0,510 0,525 0,540 0i550 0,555 0,560 0,560 0,065 0,2 0,645 0,640 0,635 0,630 0,625 0,625 0,020 Е5 ДЕ= С * 0,184. ВНИИПИ Заказ 3361/43 Тираж 897 Подписное Филиал ЛПП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4. Е ЛЕ С 1,25 Определение -оксибутирата. Вносят р -оксибутиратдегидрогена10 эу ° IV Ео Е 20 ДЕ С = 1,013 Определение пирувата, оксалоацетата, А -кетоглутарата, . диоксиацетонфосфата и ацетоацетата. Состав реакционной смеси; Буфер триэтаноламин солянокислый 0,1И, рН 7,5, мл 2,7 НАДН 3 мг/мп, мл 0,1 30 Нейтрализованный экстракт., мл Фермент, мкг Общий объем смеси 3 мл. Определение ведется при длине вол-З5 ны 340 нм, слепой опыт не содержит кофермента. Реакцию начинают внесением фермента для определения пирувата лактатдегидрогенаэы. Регистрируется Ео . Реакция учитывается до стаби- а0 лизации показателя оптической плотности в течение 3-5 мин, (Е ). После" довательным внесением малатдегидрогенаэы, глутаматдегидрогеназы,с -глицерофосфатдегидрогенаэы и Р -оксибу- g$ тиратдегидрогеназы регистрируется уменьшение оптической ппотности (Е, Е» Е и Е ) Ь Е соответствует содержанию в пробе оксалоацетата,< -кето глутарата, диоксиацетонфосфата,ацета- у ацетата. Определение пирувата. Вносят лактатдегидрогенаэу Eî 0,740 0,735 0,730 0,723 0,718 0,712 Е 0,712 Е= 0,028 А С 0,409. Определение оксалоацетата. Вносят малатдевндрогеназу Еа 0,715 0,700 0,695 01690 Е 0,690 ДЕ= 0,025 С 0,366 Определение о -кетоглутарата. Вносят глутаматдегидрогеназу Ео 0,695 0,680 0,672 0,650 0,650 0,645 Е 0,645 Е= О ° 040 Ь С 0,586 Определение диоксиацетонфосфата. Вносят о — глицеоофосфатдегидрогеназу Ео Е АЕ= С 0,293 Определение ацетоацетата. Вносят -оксибутиратдегидрогеназу Е 0,630 0,625 0,620 0,617 0,617 0,013
