Способ получения биомассы менингококка

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МЕНИНГОКОККА ДЛЯ приготовления диагностических препаратов путем посева инокулята в питательную среду. выращивания в условиях аэрации и перемешивания с последуюпщм вь1делением целевого продукта, отличающийся тем, 4Td, с целью повышения специфической активности диагностических препаратов, в качестве инокулятаиспользуют суспензию менингококка, образующего колонии в S-форме, перемешивание осуществляют со скоростью 50-100 об/мин в начале процесса с постепенным увеличением числа оборотов мешалки до 250-300 в минуту, а аэрацию проводят путем подачи воздуха со скоростью 1020 л/мин в начале процесса с увеличением ее до 100-150 л/мин в конце процесса, при этом концентрацию раст л воренного в среде кислорода поддерживают на уровне 10-20% от полного насыщения, и вьщеляют целевой продукт на стадии снижения удельной скорости роста от максимальных до 2/3 макс 1альиых значений. СП Р со 4: 00

1159

948!

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения биомассы менингококков, используемой для приготовления диагностических препаратов. S

Известен способ получения биомас" сы менингококка для приготовления диагностических препаратов путем посева инокулята в питательную среду, выращивания в условиях аэрации и перемешивания с последующим вьщелением целевого продукта (1) .

Однако известный способ не обеснечивжт высокой специфической активности диагностических препаратов. IS

Целью изобретения является повышение специфической активности .диагностических препаратов.

Эта цель достигается тем, что согласно способу получения. биомассы 20 менингококка для приготовления диагностических препаратов путем посева инокулята в питательную среду, выращивания в условиях аэрации и переме-. шивания с последующим выделением 2S целевого продукта, в качестве инокулята используют суспензию менингококка, образующего колонии в S-форме, перемешивание осуществляют со скоростью 50-100 об/мин в начале процес-ЗО са с постепенным увеличением числа оборотов мешалки до 250-300 в минуту, а аэрацию проводят путем подачи воздуха со скоростью 10-20 л/рин в начале процесса с увеличением ее до

100-150 л/мин в конце. процесса, при этом концентрацию растворенного в среде кислорода поддерживают на уровне 1.0-20% от полного насыщения, и вьщеляют целевой продукт на стадии снижения удельной скорости роста от максимальных до 2/3 максимальных значений, I

Пример 1. Штамм Neisseria

imeningitidis Вс5 хранят в высушенном 45 ,,состоянии в ампулах, культуру для . ° которых готовят из одной колонии, находящейся в 5-форме. Культуру из ампулы засевают в чашки Петри на

1,5Х-ный агар Хоттингера с добавле- Se кием 207 сыворотки крупного рогатого скота и выращивают при 37 С в термостате в течение 18 ч в атмосфере

СО

Выросшую культуру (1-2 чашки) у смывают физиологическим раствором при рН 7,0 и делают второй пассаж . на чашки. Смыв культуры из второго пассажа засевают в ферментер с жидкой питательной средой, в которой в качестве источника азота взят казеиновый гидролизат с содержанием азота

150-160 мгХ, в качестве источника углерода — крахмал растворимый, в качестве минеральных солей КН РО, 4

МоС1, Си804, хлориды, в качестве стимуляторов роста — цистеин, глютаминовую кислоту и диализат дрожжей при следующем соотношении компонентов: каэеиновый гидролиэат из расчета в готовом продукте 150-160 мг7. аминного азота, минеральные сали, r:

КН РО 0,5; МяС1 О 4; CuSO 0,00125; цистеин .0,03; диализат дрожжей

100 мл; глютаминовая кислота 0,75.г; хлориды 0,8 г; крахмал растворимый .

1,0 г; дистиллированная вода до

1,0 л.

Инокулят вносят из расчета 0,11,4 млрд клеток на 1 мл питательной

1среды. Выращивание в ферментере осуществляют при постоянном увеличении числа оборотов мешалки от 50 в..минуту в начале процесса до 250 в мину-. ту в конце и подачи воздуха от 10 л в минуту в начале процесса до 100 л в минуту в конце, при этом концентрация растворенного в среде кислорода поддерживается на уровне не ниже

103 от полного насыщения. Собирают целевой продукт - биомассу на стадии, нри которой удельная скорость роста равна максимальной для данной среды величине, равной 1,0 ч . Биомассу собирают вместе с культуральной жидкостью в тот период, когда оптическая плотность популяции достигает 2 ед.Et, Фиксацию культуры для получения группоспецифических сывороток осуществляют путем однократного замораживания и последующего. длительного хранения живой культуры нужной фазы развития при -.20 С; фиксацию:культуры для реакции агглютинации на стекле осуществляют путем,лиофильного высушивания; фиксацию культуры для реакции преципитации в агаре и встречного электрофореза осуществляют путем действия мертиолята, сбора клеток центрифугированием, разрушения поверхностных слоев клеточной стенки щелочными значениями рй и высушиваиия трехкратной обработкой ацетоном; фиксацию культуры для приготовления эритроцитарных антигенных диагностикумов осуществляют путем действия гомологично сер пы Вс5 хххх хххх серогруппы В-13090 хххх ххх . ххх серогруппы С-0638

3 1159 мертиолята, сбора клеток центрифугированием, разрушения полученной влажной массы ультразвуком, выделения растворимых антигенов-сенситинов.

Hp и и е р 2. Посев культуры из ампулы на ча шки с сывороточным ага ром, а затем пересев культуры второго пассажа с чашек в фериентер с жидкой питательной средой осуществляется по примеру 1. Состав жидкой среды, r: 4О

Казаминовые кислоты 10,0

На НР04 10,0

КС1 0,09

MogS0 7Н 0 . 0,06

Глюкоза 5 0 рИ 7,4

Выращивайие в ферментере осуществляют нри постепенном увеличении оборотов мешалки от 100 .в минуту в начале процесса до 300 в минуту в конце о и при подаче воздуха от 20 л в минуту в начале процесса до 150 л в конце. При этом концентрация растворенного в среде кислорода .поддерживается на уровне 20% от полного насыщения.

Собирают целевой продукт — биомассу на стадии, при которой удельная скорость роста равна величине, составляющей 2/3 максимальной, т.е.

0,66 ч . Биомассу собирают вместе с культуральной жидкостью.

Фиксацию культуры осуществляют по примеру 1., Способ позволяет накопить биомассу, которая может быть использована для получения диагностических сывороток и других диагностических препаратов..После иммунизации кроликов этой биомассой по общепринятой схе-. ме получены менингококковые сыворот40 " гетерологичной серогруппы А-208

948 4 ки, отличающиеся высокой групповой специфичностью, стандартностью, активностью. Данные приведены в табл. и 2. l

0 возможности использовать биомассу, полученную предлагаемым способом, в качестве антигена в реакции микропреципитации в агаре свидетельствуют следующие результаты. После сбора биомассы, центрифугирования и доведения до 50 ед. мутности ее подвергают действию раствора мертиолата 1:10000 и щелочных значении рН 9,0-9,2 в течение часа. Результаты микропреципитации этой биомассы с соответствующими сыворотками представлены в табл.3.

Использование способа позволяет получать биомассу менингококка серогруппы В, .обладающую высокой групповой специфичностью, сыворотки, полученные против этой биомассы, помимо высокой групповой специфичности, обладают высокой чувствительностью, что улучшает диагностику.

Для сенсибилизации эритроцитов с целью получения ультразвукового эритроцитарного диагностикума, дающего одной силы реакцию, требует- ся в 200 раз меньшее количество биомассы, полученной предлагаемый способом, Кроме того, разработанная технология приготовления диагностических сывороток, включающая фиксацию биомассы замораживанием, позво ляет в 30-40 раз сократить время, идущее иа выращивание культуры и стабилизовать свойства биомассы и нолучаемых из нее .сывороток.

Таблица 1

1159948

Таблица 2

Таблица 3

Титры антител

Способ по- ¹ сыворотки лучения РаэведеКолиние анти- чество гена полос

Известный

1: 160

lO 1

1:8

Нераэве- 1 денная

1: 160

1:16

Нераэве- 1 денная

ПредлагаеMblH

И

1:4096

4910

1:2

4910 1:32

4911 1:4

4911

1:4

4914

29 4913 1: 16

1:4. 4914 1:8

4915

1:4

1: 1024

4916

1:16

1:2

1: 4096

4917

1:32

1:4

1:4096 4918 1: 16

4918

1:2

1:4096

4919

1:4

Эр 4919 1: 32

Составитель Г. Смирнова

Редактор Т. Кугрышева Техред З.Палий Корректор А. Тяско

Заказ 3693/23 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал IIIIII "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1:10

1:80

1: 256

1:1024

1! 128! № сыво5 ротки 4916 фЯ

4917

Разведение сиворотки