Непланоцин @ или его производные в качестве промежуточных продуктов в синтезе непланоцина @

 

Непланоцин D или его производ .ные общей формулы Л ROHgC. RO OR где . (Л X ОН, SH, или с , в качестве промежуточных продуктов в синтезе непланоцина А.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

4(51) С 07 D 235/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ - j ъ с г .

М ! i

R0 08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3408425/23-04; 2763801/28-13;

2914346/30-15 (22) 02.03.82 (23) 17.05.79; 16.04.80 (31) 54-8205 (32) 29.01.79 (33) Япония (46) 07. 07. 85. Бкл. М 25 (72) Масару Отани, Сатоси Ягинума,,Иасатоси Цудзино, Наоки Муто, Тецу

Camo и Тадасиро Фудзии (Япония) (71) Тойо Дзозо Кабусики Кайся (Япония) (53) 547.857.2.07(088.8) (56) 1. Jaginuma S,, Nuto N., Tsujino М., Sudate I. Nayashi М., Otani М.

Studies on neplanocin А, new antitumor Antibiotic. — Journal of Anti,biotics,34(4), 359, (1981) .

„„SU„„1 5680 (54) НЕПЛАНОЦИН D ИЛИ ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ

В КАЧЕСТВЕ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

В СИНТЕЗЕ НЕПЛАНОЦИНА А. (57) Непланоцин D или его производные общей формулы

Х где R-Н;

Х вЂ” ОН, $Н, SCH или R=Ac;

X=Cl, в качестве промежуточных продуктов в синтезе непланоцина А.! 1165680 2

Изобретение относится к новым непланоцинам П и его производным общей формулы

RO 0R

l5 где R--H-, Х ОН, SH, SCH или

R=Ac;

X=CI, которые используются в качестве промежуточных продуктов в синтезе непланоцина A.

Непланоцин А оказывает подавляющее действие на патогенные микроорганизмы растений, а также обладает противоопухолевой активностью. Его получают путем инокулирования штамма вида Ampullariella А,11079 FERM-P

9 4494 в питательной среде.. Выделе30 ние антибиотика осуществляется путем поглощения адсорбентами с последующим элюированием водноорганическими растворами (1) .

Недостатками способа получения непланоцина А является его низкий выход, трудоемкость процесса, громоздкость аппаратурного оформления про изводства.

Целью изобретения является химический синтез непланоцина А из непла40

-ноцина D и его производных, который получают в качестве побочного . продукта при микробиологическом производстве непланоцина А.

Непланоцин D получают путем ино; кулирования штамма вида Ampullariella А11079 FERM-P У 4494 в питательной среде.

Микроорганизмы могут выращивать- 50 ся различными способами в искусственной или естественной среде, жидкой или твердой культуре. При промышленном получении предпочтительна жидкая среда. Для составления среды 55 могут применяться усваиваемые источндки углерода и азота, неорганические соли и другие вещества. Эта среда применяется для микроорганизмов, производящих антибиотики-непланоцины. В качестве источника углерода может применяться глюкоза, сахароза, глицерин, растворимый крахмал и тому подобные материалы.

В качестве источников усваиваемого азота. могут применяться пентон, порошок соевых бобов, экстракт ITlllpницы, мясной экстракт, рисовые отруб :, гидролизат казеина, нитрат, аммониевая соль и т.п. Могут также применяться неорганические соли, такие как хлористый натрий, фосфаты кальция, магния, железа III или марганца. Может добавляться противопенное вещество, такое как силиконовое или соевое масло.

В случае жидкой культуры предпочтительно применять погруженную аэрируемую культуру. В этом случае выращивание осуществляют при оптимальной для микроорганизмов темперао туре, предпочтительно при 25-30 С.

Продолжительность выращивания зависит от применяемых условий и обычно равна 2-4 дням. рН среды при выращивании регулируется.от нейтральной до слегка кислой.

Такая культурная среда содержит антибиотики-непланоцины. Выделение антибиотиков-непланоцинов может быть осуществлено стандартным выделением или отделением (способами,. применяемыми для выделения продуктов обмена микроорганизмов). Так как непланоцины представляют собой слабые основания, они могут быть выделены путем поглощения приемлемыми адсорбентами с последующим элюированием подходящим растворителем. В качестве адсорбентов могут применять- ся активированный уголь, катионообменные смолы, активированный глинозем или силикагель. Элюирующие растворители выбирают в зависимости . от применяемого адсорбента, например, это могут быть смешивающиеся с водой

I органические растворители, такие как водный метанол, водный ацетон или водный.диоксан. или растворы солей, или кислот, щелочные растворы.

Кроме того, непланоцины могут выделяться и очищаться как вещества слабощелочной природы. Например, антибиотики поглощают катионообменной смолой, такой как Амберлит 1РС-50 (торговая марка продукта фирмы

1165680

ОН

НОСК

Веосн2

НО 0Н

НепяаноцииЯ

OBz 0Hz

$Н

М М

ВгОСН

ОБ ОН

OBz Oaz

"Ром и Хаас", США) или Доувек 50 (торговая марка продукта фирмы

"Доу Кемикл", США) н элюируют приемлемым кисловым, щелочным или солевым раствором.. Для выделения, элюирования и очистки антибиотиков предпочтительно применять сочетание адсорбента и ионообменной смолы . Например, фильтрат культуры загружают в. катионообменную смолу Амберлит IR-120 (торговая марка) для поглощения антибиотика, элюируют щелочным раствором, например 3,7 н. водным раствором аммиака, с получением активной Фракции, и после регулирования рН до нейтральной или слабощелочной среды антибиотики адсорбируют активированным углем с последующим элюированием 70Х-ным метанолом. Элюент адсорбируют анионообменной смолой Амберлит IRA-410 (торговая марка) и вновь элюируют водой для сбора активных фракций. Объединенные фракции концентрируют, получая сырой продукт, который затем подвергают очистке на силикагеле. Дальнейшую очистку осуществляют перекристаллизацией. Чистота соединения может быть определена по точке плавления или по одному пятну на бумажной хроматографии, тонкослойной хроматографии и бумажном электрофорезе при 2630 А УФ-света.

Для этого три гидроксильные группы в циклопентеновом кольце неплано5 цина D защищают путем взаимодействия .с бензоилхлоридом. Гидроксильную группу в адениновой структуре неппа. ноцина D заменяют маркапто-группой, для чего осуществляют реакцию с пяти1ц сернистым фосфором, затем удаляют saщитную группу для гидроксильной группы, в результате чего получают производное непланоцина Р (III). Метилированием его метилйодидом получают производное непланоцина D (IV), которое обрабатывают метанольным аммиаком, в результате чего получают непланоцин А.

Кроме того, три гидроксильных группы в циклопентеновом кольце неплано2б цина D защищают путем ацетилирова- ния. Этого достигают взаимодействием с уксусным ангидридом. Затем указайное соединение превращают в производное непланоцина D (VI) путем взаимодействия с хлористым тионилом. Производное непланоцина D (ЧТ)может пре вращаться в непланоцин А через производное непланоцина D путем обработки метанольным раствором амми б ака.

Описанные реакции могут быть про-, иллюстрированы следующей схемой:

1165680 снзд

Неппаноцин 4 цоСн>

0Н 0Н

Произ одное непланоцина Я (Ю

Неппаноцин3 W у гсусный 4 ангидрид

ЛсОМ

80(! 4

АсОСН, ЛСО 0Ас

Ac 0 ОАс й

Неппаноцин А

Пример 1. B 500-миллилитровую колбу загружают 100 мл водной среды (рН 6,5), содержащей 2Х глюкозы, 27 крахмала, 17 дрожжевого экстракта, 1% гидролизата казеина и 0 2Х карбоната кальция. Содержимое колбы стерилизуют в течение

15 мин при 120 С. В две колбы этой среды высевают одну петлю со скошенной культурой вида Ampullariella

А 11079 FERM-P Ф 4494 и встряхивают при 30 С. Через четыре дня кульо туральную среду переносят в 20 л такой же, как указанная стерилизованной среды, которая находится в

30-литровом бродильном чане, и выращивают при 30 С при перемешивании о с 300 об/мин и аэрировании 20 л/мин

;в течение 48 ч, Выращенную таким путем средУ пе- у реводят в 200 л водной среды (рН 6,5) содержащей 4Х глюкозы, 1Х порошка соевых бобов, 0,47 мясного экс, тракта, 0,47. пептона, 0,17. дрожжевого экстракта, 0,25% хлористого у натрия и О, 1Х карбоната кальция, о и выращивают при 30 С при перемешивании с 180 об/мин и аэрировании

Произшло оное непла ноиина 3

ОО л/мин в течение 40 ч. Полученный бульон (200 л) фильтруют, и грибницу промывают водой. Фильтрат и промывочную воду объединяют, в результате чего получают примерно

140 л прозрачного фильтрата.

К фильтрату добавляют 3,6 кг порошка активированного угля. После перемешивания в течение 40 мин активированный уголь отфильтровывают и тщательно промывают водой. Злюирование осуществляют 70%-ным метанольным раствором. 40 л элюата сушат в вакууме,. получая 80 r сырого порошка, содержащего непланоцин П.

В колонку, заполненную 6 л силикагеля со смесью растворителей -про. панол:концентрированный водный раствор аммиака:вода (10:1:1), вводят

80 r сырого порошка и затем элюируют его той .же смесью растворителей.

Фракционируют каждые 600 r элюата:

Непланоцин D найден во фракциях

N И 20-37, Указанные активные фракции собирают, концентрируют в вакууме до 30 мл и выдерживают при охлаждении. Фильтрованием отделяют осадок, в .результате чего получают

1165680

460 мг сырого кристаллического непланоиина D.

460 г сырых кристаллов растворяют в 3 л горячей воды и вводят в колонку с Сефадексом С-15 (!850 мл, заполненную водой), затем элюируют водой. Фракционируют каждые 100 мл элюата, собирают фракции элюата

N,N — 15-16 (200 мл) и концентрируют при пониженном давлении до

20 мл. Полученный концентрат выдерживают при комнатной температуре.

Получают 314 мг выделившегося в осадок непланоцина D в виде белых кристаллов.

Непланоцин 0 имеет следующие физико-химические характеристики: элементный анализ,X: С 49,70;

Н 4,64; М 21,20; мол. масса (определена из масс-спектрального анализа).:

:264; т.пл. 236-237 С; удельное вращение:(оД =-145 (с=0,6Ж Н,О).

Спектр ультрафиолетового поглоО 11

В воде: 11щ =2510 А F.1 „=479., В кислой воде: 9 „,,„=2510 А, В щелочной воде: Ъ „=2360 А

Инфракрасный спектр поглощения (КВг): полосы поглощения при 34203120, 2940-2880, 1680, 1580. 1545.

1510, 1440, 1390, 1305, 1210, 1110, 1075„

1040, 1000, 990, 975,,900, 845, 780 см 1.

Растворим в воде, диметилсульфок. сиде, диметилформамиде, уксусной кислоте и пиридине.

Нерастворим в этиловом эфире уксусной кислоты, хлороформе, бензоле и гексане.

Цветная реакция. Положительная: обесцвечивает перманганат калия и окисляет перйодат; отрицательная: нингидрин, фелинг и хлорид железа (III).

Цвет: белые игольчатые кристаллы, Ry величина (силикагель, фирмы

"Токио Касей", силикагель (f) и -бутанол:уксусная кислота:вода (6:1:1)

К =0,27; Н -бутанол:конц.нашатырный сйирт:вода (10:0,5:2) R =0,07;

Н-пропанол:конц.нашатырный спирт: вода (10: 1: 1) R)=0, 18; ацетон:вода (10: 1) К =0,33.

45

55 тики:( Н,, $,1 О S; мол. масса 592; т. пл. 235-239 С (разложение пены).

Пример 2. 376 мг непланоцина D растворенного в 10 мл безводного пирицина, тщательно перемешио вают при 55 С. По каплям к раствору добавляют 0,8 мл хлористого бензоила и перемешивают в течение 2 ч при 60-65 С.

Зятем раствор выдерживают при

40-45 С, в течение 8 ч при комнатной температуре, При перемешивании добавляют 10 мл воды и спустя 25 мин сушат при пониженном давлении в испарителе. Высушенный материал растворяют в 30 мл хлороформа, промывают трижды 10 мл однонормальной соляной кислоты и дважды однонор15 мальным раствором бикарбоната натрия после чего дважды промывают 20 мл воды. Хлороформный слой обезвоживают безводным сульфатом магния и концентрируют до получения 747 мг

2Р соединения формулы (1)бледно-розовой окраски (выход 91K).

Соединение формуль (Х) имеет следующие физико-химические харак- теристики:(о ) =-199 (с=0,6, мета2Ъ 9

25 нол); молекулярная формула

СэгHç4N O7, мол масса 576 (массо спектр); т. пл. 116-177 С. Уф-спектр оглощения A « 232 A Е 704

1 4

R -величина (хлороформ:метанол

3р 10:1) Ry=0,53.

Тщательно перемешивают 735 мг соединения формулы (I), приготовленного выше, и 1,0736 г пентасульфида фосфора, растворенного в 19 мл пи ридина. К смеси по каплям добавляют

0,19 мл воды. После кипячения с обратным холодильником в течение 4 ч при перемешивании реакционную смесь охлаждают и концентрируют в вакууме

B результате получают коричневый маслянистый продукт. Маслянистый продукт вливают в кипящую воду при перемешивании и дополнительно перемешивают в течение 30 мин, получая . желтоватый материал. Его фильтруют для отделения осадка, промывают смесью этилового спирта и серного эфира (1:1), дополнительно промывают. серным эфиром и сушат, в результате чего получают 561 мг соединения формулы (II). Выход 74,37..

Соединение формулы II имеет следующие физико-химические характерис1165680

10,.,УФ-спектр (в метаноле): 2320 Д"

Е с< =858,5; 3230 А =- 327ь5. " величина (хлороформ:метанол 10:1)

R(=0,82.

Пример 3. В 31 мл безводного метилового спирта растворяют

525 мг соединения формулы (II), лов лученного в примере 2. Добавляют

0,62 мл свежеприготовленного двухнормального раствора метилата натрия в метаноле и кипятят при перемешивании в течение 2 ч с обратным холадильником, в результате чего удаляют бензоильные группы.

После отгонки метилового спирта добавляют примерно 50 мл Н,О и регулируют рН до 7,5 добавлением уксусной кислоты. Раствор дважды экстрагируют 20 мл этилового эфира уксусной кислоты и концентрируют водный слой, получая производное непланоцина D формулы (III) в виде игольчатых кристаллов..Осуществляют перекристаллизацию из горячей воды, получая 110 мг производного .непланоцина

D формулы (III) . Выход 44,3Х.

Производное непланоцина D формулы (Ш) имеет следующие физикохимические свойства: удельное враще- ЗО ние невозможно измерить иэ-за изменения величины при измерении. Молекулярная формула С1 Н 1 М40, Мол. масса 280 (по масс-спектру); т. пл. 260262 С (с разложением). УФ-спектр в 35 о воде: 2260 А (Е,,„=388,6), 3240 А (E <, =968, 0) . Величина Ry (пропанол: конц. водный аммиак: вода=10: 1: 1)

R)=0, 21.

П ф и и е р 4. К раствору 37 мг 40 производного непланоцина D формулы (III), приготовленного по примеру 3, в 0,3 мл 0,4 н. гидроокиси натрия добавляют 0,009 мл метилйоднда и встряхивают при комнатной температу- 15 ре в течение 10 мин. Затем добавляют

0,05 мл 0,4 н. гидроокиси натрия и дополнительно добавляют 0,009 мл йодистого метила, вновь встряхивают и выдерживают при комнатной темпера- 50 туре. К этому раствору добавляют

10 мл воды, концентрируют в вакууме .до 2 мл и вносят в колонку 1,4х49 см, заполненную Сефадексом G-15. Элюирование осуществляют водой и фракцио — 55 нируют каждые 3 r элюата. Собирают фракции К,N 17-19, концентрируют и охпаждают, получая 35 мг кристаллического производного непланоцина

D формулы (IV). Выход 90Х.

Производное непланоцина Р Формулы (1Ч) имеет следующие физикогъ химические характеристики:(otj

=141,7 (с=0,7, вода); молекулярная формула Сig Н м N O S; мол. масса 294 (масс.-спектр); т. пл. 177-178 С. р

УФ-спектр в воде: 2220 А (Е, „„=

=415,8); 2880 А (Е1см =676,));

2950 А (E 1см 415 8) 2880 А

Величина Rg (пропанол:конц.водный раствор аммиака:вода=1: 1:1)

R3=0,42.

Пример 5. Синтез непланоцина А из производного непланоцина D формулы (IV).

50 мг производного непланоцина D . формулы (IV) полученного в соответствии с той же методикой, что описана в примере 4, растворенного в

1,5 мл метанольного раствора аммиака (О С, насыщение), помещают в зао паянную трубку и выдерживают при 146, 148 С в течение 7 ч. После удаь ления растворителя при пониженном давлении остаток растворяют в 3 мл горячей воды, затем охлаждают., получая 33 мг непланоцина А в виде иголь. чатых кристаллов. Выход 74Х.

Пример 6. К 1,14 г непланоцина D в 12 мл безводного пиридина добавляют 1 мл уксусного ангидрида и выдерживают при комнатной температуре в течение 8 ч. Добавляют 30 мл

Ц -гексана и охлаждают в ледяной воде, получая 1 r кристаллического соединения. формулы (V) .

1 r соединения формулы Ч добавляют к 25 мл раствора 0,8 мл тионилхлорида и 0,4 мл диметилформамида в хлороформе и кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч при комнатной температуре. Хлороформ отгоняют при пониженном давлении. Остаток вливают в 100 мл ледяной воды при перемешивании. Осуществляют.экстракцию 100 мл хлороформа, промывают бикарбонатом натрия и водой и сушат сульфатом натрия. После сушки в вакууме получают производное непланоцина D формулы (VI).

Пример 7. Синтез непланоцина А из производного непланоцина

Р формулы (VI).

К производному непланоцина Р формулы (VI), приготовленному в приl2

1165680

Составитель Ю. Белоусов

Редактор Н. Егорова Техред Т.Иаточка Корректор Е, Рошко, Заказ 4282/22 Тираж 384 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 мере б и помещенному в стальную закрытую трубку, добавляют 35 мл насыщенного раствора аммиака в метиловом спирте и проводят реакцию при 100 С в течение 5 ч. После охлаждения реакционную массу сушат в вакууме и получают кристаллический поро— шок, который подвергают хроматографической очистке на силикагеле. Получают 286 мг непла .íîöèíà А.

Физико-химические характеристикй идентичны тем, которые отвечают известному непланоцину А.

Представленный химический син5 теэ непланоцина А из непланоцина Р осуществляется при более высоких концентрациях (химический процесс), чем при ферментации, что позволяет испольэовать небольшие компактные реакционные сосуды и простые условия проведения. реакционного процесса.