Способ определения фосфогидролаз в тканях

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОГИДРОЛАЗ В ТКАНЯХ, включающий их фиксацию в буферном растворе «-формальдегида , промывку в растворе сахарозы и инкубацию в среде, содержащей исследуемый субстрат, буферный раствор, соли магния и свинца, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения фиксацию проводят в течение 1,5-2 ч в-составе , содержащем в качестве буферного раствора 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4при следующем соотношении компонентов, мае. %: rt-Формальдегид2,0-4,0 0,1 fA фосфатный буфер с рН 7,4Остальное а инкубацию проводят в течение 25-30 мин при 36-37°С в среде, дополнительно содержащей сахарозу, а в качестве буферного раствора - трыс-малеатный буфер с рН 7,2 при следующем соотношении компонентов, мМ: Исследуемый субстрат2-2,2 Соль магния2-2,2 Сахароза0,25-0,28 Соль свинца2-2,2 I rpwc-Малеатный буфер с рН 7,280-90 kл и по выпадению осадка определяют наличие фосфогидролаз.

COOS СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3583423/28-13 (22) 18.04.83 (46) 07.07.85. Бюл. № 25 (72) И. Б. Бухвалов (71) Всесоюзный научно-исследовательский центр по охране здоровья матери и ребенка (53) 61 6-098.8 (088;8) (56) Гайер Г. Электронная гистохимия.

1969, с. 15. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОГИДРОЛАЗ В ТКАНЯХ, включаюший их фиксацию в буферном растворе п-формальдегида, промывку в растворе сахарозы и инкубацию в среде, содержащей исследуемый субстрат, буферный раствор, соли магния и свинца, отличающийся тем, что, с .целью повышения точности определения фиксацию проводят в течение 1,5 — 2 ч в составе, содержащем в качестве буферного

„„SU„„1165920 А

q(5)) G 01 N 1/28, А 61 В 10/00 раствора О,1 М фосфатный буфер с рН 7,4. при следуюшем соотношении компонентов, мас. %: п-Формальдегид 2,0 — 4,0

0,1 М фосфатный буфер с р Н 7,4 Остальное а инкубацию проводят в течение 25 — 30 мин при 36 — 37 С в среде, дополнительно содержашей сахарозу. а в качестве буферного раствора — трис-малеатный буфер с рН 7,2 при следующем соотношении компонентов, мМ:

Исследуемый субстрат 2 — 2,2

Соль магния 2 — 2,2

Сахароза 0,25 — 0,28

Соль свинца 2 — 2,2 трис-Малеатный буфер с рН 7,2 80 — 90 и bio выпадению осадка определяют наличие фосфогидролаз.

1!

Изобретение относится к медицине, в частности к гистологии и цитохимии ферментов, и может быть использовано в практической медицине и биологии.

Цель изобретения — повышение точности определения.

Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемую ткань фиксируют в течение

1,5 — 2 ч в составе: 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4, содержавший.пформальдегид 2,0—

4,0 мас. В. Затем. промывают в растворе сахарозы и изготавливают с этих кусочков в криостате срезы толщиной 40 — 50 мкм.

Полученные срезы инкубируют в течение

25 — 30 мин при 36 — 37 С в среде состава, мМ: субстрат 2 — 2,2, трис-малеатный буфер с рН 7,2 80 — 90, соль магния 2 — 2,2, сахароза

0,25 — 0,28, соль свинца 2 — 2,2. По выпадению осадка определяют наличие фосфогидролаз.

Пример 1. Проводят ультрацитохимическое определение фосфогидролаз (АТФазы и 5-нуклеотидазы) в клетках печени белых крыс.

Кусочки печени крысы толщиной 2 — 3 мм фиксируют 2 ч в фиксирующей смеси следующего состава: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 3 мас. l пформальдегида при 4 С, промывают в трех сменах

0.25 М сахарозы при 4 С соответственно

10, 20 в 30 мин и изготавливают с этих кусочков в криостате срезы толщиной 40—

50 мкм. Полученные срезы затем инкубируют

30 мин при 37 С в инкубационной среде состава, мМ: субстрат 2,1; трис-малеатный буфер с рН 7,2 85; соль магния 2,1; сахароза 0,26; соль свинца 2,1. В качестве субстрата используют АТФ, 5-АМФ и р-глицерофосфат натрия. Активность АТФазы и

5-нуклеотидазы определяют на плазматической мембране в эндоплазматическом ретикулуме и комплекте Гольджи, в ядерной оболочке, хроматине и ядерных рибонуклеопротеидах — в ядрышках, интерхроматиновых и перихроматиновых гранулах, перихроматиновых фибрилах и клубочковидных

65920

2 тельцах. Отрицательная реакция с р-глицерофосфатом натрия свидетельствует о специфичности гистохимической реакции на АТФазу и 5-нуклеотидазу.

Пример 2. Кусочки . печени крысы толщиной 2 — 3 мм фиксируют 2 ч в 1,5Я-ном растворе глутаральдегида на 0,067 М какодилатном буфере (рН 7,2) при 4 С, промывают в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2) с добавлением 7,5"/о-ной сахарозы и затем инкубируют 30 мин при 37 С в следующей среде, мМ: АТФ или 5-АМФ 0,83; трисНС1 — буфер (рН 7,2) 80; сульфат магния

10; нитрат свинца 3,6. Далее образец подвергают обработке и электронномикроскопическому исследованию по общедоступной м етоди ке.

Активность АТФазы и 5-нуклеотидазы определяют практически только на плазматической мембране. В редких клетках слабую активность можно наблюдать в ядрышках клеток. Кроме того, по всем клеткам наблюдается слабый, равномерно распределенный диффузный осадок за счет высокого уровня неферментативного гидролиза субстрата до 370 согласно биохимическим определениям в среде данного состава.

Изобретение позволяет повысить точность определения (доля неферментативного гидролиза, определенная биохимически, составляет по известному способу 37оо, по предлагаемому — 4,4о), устойчивость (стабильность) инкубационной среды за счет введения в среду с буферной смесью хелатирующего агента (малеата) и установления эквимолярного соотношения концентраций (по 2 мМ) ионов свинца, ионов магния или субстрата, упростить процесс, сделав возможным его использование для определения различных фосфогидролаз (АТФаза, 5-нуклеотидаза, Г-6-Ф-аза, неспецифическая фосфатаза) и проведения серийных экспериментов, а также одновременного создания дополнительных контрольных проб для каждой из фосфогидролаз, исследуемых в данной серии опытов.

Редактор О. Головач

За каз 4300/34

Составитель В. Чистяков

Техред И. Верес Корректор А. Тяско

Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и оз крытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/8

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4