Способ получения сорбента для хроматографического разделения биополимеров

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕВИЯ БИОПОЛИМЕРОВ, включающий обработку кремнеземного носителя раствором , содержащим полимер N- винилпирролидона , отличающийся тем, что, с целью повьшения разделяющей способности и стабильности .сорбента , в качестве носителя используют модифицированный уаминопропилтриэтоксисиланом кремнезем и обработку ведут раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида в органическом растворителе с последукяцим контактированием с раствором этаноламина. 2. Способ по П.1 отличаю .щ и и с я тем, что используют 2-3%ный раствор сополимера м-винилпирролидона и акрилоилхлорида.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОВэЕТЕНИЯ " "

N ilBT0PCHOMV С У

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИ ГЕТ ССОР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧЯРЦТИЙ (21) 3606895/23-26 (22) 17.06 .83 (46) 15.07.85. Бюл. 9 26

{72) А.Е..Иванов, Л.С.Жигис, С.И.Туркин, П.д.Решетов и В.П.Зубов (71) Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина (53) 661.183. 1(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

9 1071306, кл. В 01 Х 20/10, 1981.

Авторское свидетельство СССР

Р 467883, кл. В 01 3 15/08, 1972. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕВТА ЛЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ, включающий обработку кремнеэемного носителя раство„„SU„„1166751 А ром, содержащим полимер М вЂ” винилпирролидона, отличающийся тем, что, с целью повышения разделяющей способности и стабильности .сорбента, в качестве носителя используют модифицированный т- аминопропил-, триэтоксисиланом кремнезем и обработку ведут раствором сополимера К-винилпирролидона и акрилоилхлорида в органическом растворителе с последующим контактированием с раствором этаноламина.

2. Способ по п.1 о т л и ч а юшийся тем, что используют 2-3Ъный раствор сополимера N --винилпирролидона и акрилоилхлорида.

1166751

Изобретение относится к способам

I получения сорбентов для разделения и очистки биополимеров и может быть использовано для хроматографической очистки вирусных суспензий при приготовлении вакцин. 5

Цель изобретения — повышение разделяющ и способности и стабильности сорбента.

Сущность способа заключается в последовательной обработке кремнезе- 0 ма 1-- АПТЭС, сополимерОм Н вЂ” винилпирролидона и акрилоилхлорида и этаноламином.

Согласно изобретению для получения сорбента используют макропористый кремнезем, характеризующийся средним размером пор 1100 А - 2000 A и удельной поверхностью 20-50 м /r.

Обработку кремнезема раствором сополимера М-винилпирролидона и акрилоилхлорида осуществляют при комнатной температуре, 1,5-2 ч. Используют

1-4Ъ -ный (лучше 2-3Ъ -ный) раствор сополимера в органическом растворителе, выбранном из группы: диметилформамид, диоксан или их смесь.

При использовании раствора сополимера с концентрацией меньше 1% снижается разделяющая способность сорбента, при содержании сополимера больше 4% сополимер выпадает в оса- 30 док. Взаимодействие с этаноламином проводят также при комнатной температуре 2-16 (лучше 10-15) ч.

Перед обработкой раствором сополимера кремнезем модифицируют извест- 35 ным приемом 1-4% -ным раствором

АПТЭС в органическом растворителе при нагревании до 70-120 С. В качестве растворителя применяют алифатические спирты С -С, алифатические 40 углеводороды С - С„, а также ароматические углеводороды С - С . Температура обработки раствором г-АПТЭС обычно определяется температурой кипения соответствующего растворителя. 45

Продолжительность модификации уАПТЭС составляет 2-4 ч для спиртовых растворов и 20 — 36 ч в случае применения углеводородных растворителей.

Отделение непрореагировавшего тАПТЭС осуществляют путем многократной экстрации органическим растворителем (эталоном, ацетоном, толуолом, диоксаном).

П р и M е р 1. 15 r макропористого кремнезема с диаметром пор 1100 А обрабатывают кипящим 3% -ным раствором 7 -АПТЭС в изопропаноле 3 ч, затем промывают 8 ч. изопропанолом в зстракторе Сокслета и сушат при 20 С

1 ч, а далее при 100 С 2 ч под вакуу-60 мом. 15 r полученного материала обрабатывают при перемешивании 3% -ным раствором сополимера Я-винилпирролидона и акрилоилхлорида (соотношение мономерных звеньев 1:1, характерис-, 65 тическая вязкость 0,20-0,25 дл/г) в сухом диоксане 2 ч при 25ОC. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порциями по 100 мл сухого диоксана и добавляют при перемешивании 5 г этаноламина. Через 10 ч после добавления этаноламина диоксановый раствор декантируют и сорбент промывают дистиллированной водой до нейтрального рН.

Пример 2. 50 г макропористого кремнезема с диаметром пор 1600 А обрабатывают кипящим 4% -ным раствором g -АПТЭС в этаноле 3 ч, промывают 8 ч этанолом в экстракторе Сокслета и сушат при 20 С 1 ч, а затем при

100 С 2 ч под вакуумом 50 r полученного материала обрабатывают при перемешивании 3% -ным раствором сополимера 8 -винилпирролидона и акрилоилго диметилформамида. Добавляют 5 г этаноламина и перемешивают. Через

2 ч после добавления этаноламина диметилформамидный раствор декантиру,ют и сорбент промывают дистилированной водой до нейтрального рН.

Пример 3. 300 r макропористого кремнезема с диаметром пор 2000 обрабатывают кипящим 2Ъ -ным раствором у-АПТЭС в толуоле 30 ч, промыА вают свежими порциями сухого толуола (Зх1л) и сухого диоксана (Зх1л). К полученной смеси кремнезема и органических растворителей прибавляют при перемешивании 1 л 2% -ного раствора сополимера 8 -винилпирролидона и акрилоилхлорида (характеристики сополимера те же, что в примере 1) в сухом диоксане и перемешивают 2 ч при

25 С. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порциями по 1 л сухого диоксана.

Добавляют 50 г этаноламина и перемешивают. Через 16 ч после прибавления этаноламина раствор декантируют и сорбент промывают дистиллированной soдой до нейтрального рН.

Пример 4. 50 г макропористого кремнезема с диаметром пор 2000А обрабатывают 1Ъ -ным раствором гАПТЭС в декане 20 ч при 120 С, промывают 8 ч этанолом в экстракторе

Сокслета и сушат при 20 C 1 ч, а затем 2 ч под вакуумом при 100 С ° 50 г полученного материала обрабатывают при перемешивании 2% -ным раствором сополимера М -винилпирролидона и акрилоилхлорида (характеристики сополимера те же, что в примере 1) в смеси сухих диоксана и диметилформамида (объемное соотношение 1:1) и перемешивают 2 ч при 25 С. После обработхлорида (соотношение мономерных звеньев 1:1, характеристическая вязкость

0,20 — 0,25 дл/г) в сухом диметилформамиде 2 ч при 25 С. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порциями по 300 мл сухо1166751

Параметры очистки вирусной суспензии на различных сорбентах

Сорбент по примеру

Общее содержание белка во фракции, мг

Весовое количество гемагглютинина во фракции, мкг

Объем вируссодержащей фракции (вирусной суспензии) после разделения,мл

РГА

1:1000

1:4000

1:4000

4,0

8,0

175

Прототип

2,1

230

5,7

2,3

230

6,0 ки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порциями по 300 мл сухого диоксана. Добавляют 5 г этаноламина и перемешивают. Через 2 ч после прибавления этаноламина раствор декантируют и сорбент промывают дистиллированной водой до нейтрального рН, Пример 5. 50 r макропористого кремнезема с диаметром пор 2000 K обрабатывают 2Ъ -ным раствором т — 10

АПТЭС в толуоле в течение 20 ч при

1 100С, промывают 8 ч ацетоном в аппарате Сокслета и сушат при 20 С 1 ч, а затем 2 ч под вакуумом при 100 С.

50 гр полученного материала обраба- 15 тывают при перемешивании 1Ъ -ным раствором сополимера М-винилпирролидона и акрилоилхлорида в диоксане (характеристики сополимера те же, что в примере 1) 2 ч при 25 С. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порциями по 300 мл сухого диоксана и прибавляют, перемешивая,5 г этаноламина.Через 2 ч

При описанном способе синтеза макромолекулы модифицирующего полимера располагаются исключительно по поверхности кремнезема и не заполняют внутренний объем пор сорбента. Это приводит к увеличению разделяющей способности сорбента. Вымывание полимера, модифицирующего поверхность, отсутствует. B таблице приведены данные, характеризующие разделяющую способность сорбентов, полученных по заявляемому и известному способу.

Как показывает таблица, вирусная суспензия, полученная на сорбенте, полученном по настоящему изобретению,55 содержит меньше примесных белков при том же или даже большем выходе вируса. Это свидетельствует о повышен-. ной разделяющей способности сорбента, полученного по предлагаемому спо-60 собу ° В таблице приведены также значения реакции гемагглютинирующей активности вируса (РГА), характеризующей сохранение его биологической функции. При использовании сорбента, 65 после этого сорбент промывают дистиллированной водой до нейтрального рН., Пример 6. Синтез сорбента проводится аналогично примеру 5, но вместо 1% -ного раствора сополимера в реакцию вводят 0,5% -ный раствор того же сополимера.

Полученный по примерам 3-6 сорбент помещают в колонку размером 1х40см, промывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 N NaИ со скоростью 1 мп/мин и в тех же условиях хроматографируют суспензию ви-. руса гриппа(штамм A385).Объем вводимой пробы 1 мл, концентрация гемагглютинина 250 мкг/мл, концентрация белков

400 мг/мл.

Содержание гемагглютинина, характеризующего выход собственно вируса, примесных белков по Кумасси и реакция гемагглютинирующей активности (РГА) во фракциях вирусного препарата, полученных на известных и предлагаемых сорбентах, приведено в таблице. полученного по заявляемому способу, РГА не только не снижается, но становится выше, чем при использовании известного сорбента.

Аналогичные результаты получены для сорбента, приготовленного в соответствии с примером 5, тогда как сорбент по примеру 6 характеризуется по» ниженными значениями выхода вируса и

РГА.

tI p и м е р 7.Через колонку 1х40 см, заполненную сорбентом„ полученным

Мо данному изобретению, пропускали

4 л фосфатного буферного раствора (0,01 И, рН 7,4), содержащего О, 1 М

NeCP . Такое промывание соответствует 100 хроматографическим разделениям. При повторении хроматографии после такой промывки выход гемагглютинина не изменяется. Содержание примесных белков остается ниже, чем при использовании сорбента, полученного по способу-прототипу.

Таким образом, предлагаемый способ получения сорбента позволяет по-, 1166751.Составитель С.Староверов

Техред Ж. Кастелевич

Корректор А.Власенко

Редактор Н.Горват

Заказ 4350/4 Тираж 541

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 лучить стабильный хроматографический материал, пригодный для многократного использования (не меньше 100 разделений против 5 для прототипа) беэ регенерации. Очистка вирусной суспензии от вирусных белков при этом остается выше,чем при использовании сорбента,полученного иэвестнымспособом.