Гептапептид, обладающий свойствами психостимулятора пролонгированного действия с иммунотропной активность
(19)RU(11)1124544(13)C(51) МПК 6 C07K7/06, A61K38/00Статус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина: учтена за 20 год с 01.07.2002 по 30.06.2003
(54) ГЕПТАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ СВОЙСТВАМИ ПСИХОСТИМУЛЯТОРА ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ С ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬ
Изобретение относится к новому биологически активному соединению - гептапептиду, обладающему свойствами психостимулятора пролонгированного действия с иммунотропной активностью, которое может найти применение в биологии и медицине. Известны близкие по аминокислотному составу аналоги тафцина, обладающие центральным активирующим, либо угнетающим действием, однако лишенные иммунотропной активности. Известен тетрапептид Thr-Lys-Pro-Arg, тафцин-фрагмент иммуноглобулина, обладающий иммунотропным действием и оказывающий кратковременное действие на центральную нервную систему (психотропный эффект). Все названные соединения: тафцин и его аналоги обладают кратковременным действием (15-20 мин). Цель изобретения - поиск новых химических соединений пептидной природы, являющихся психостимуляторами пролонгированного действия и одновременно проявляющих свойства иммуностимулятора. Поставленная цель достигается описываемым гептапептидом формулы:
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, проявляющим свойства психостимулятора пролонгированного действия с иммунотропной активностью. Описываемое соединение синтезируют с использованием классических методов пептидной химии путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-конца молекулы пептида. Синтез осуществляют с помощью N,N' -дициклогексилкарбодиимида с добавкой 1-оксибензотриазола, а также методом пентафторфениловых эфиров с последующим отщеплением защитных групп трансферным гидрированием 1,4-циклогексадиеном в присутствии палладиевой черни и хлористым водородом в диоксане. Полученный пептид в виде хлористоводородной соли пропускают через хроматографическую колонку со смолой Амберлист (АсО-форма) для обмена хлористого водорода на ацетат. Принятые сокращения:
Boc - трет-бутилоксикарбонильная группа,
Bzl - бензильная группа,
БТ - 1-оксибензтриазол,
ДЦКГ - дициклогексилкарбодиимид,
ДЦМ - дициклогексилмочевина,
ТГФ - тетрагидрофуран,
PFP - пентафторфениловый эфир,
ТЭА - триэтиламин,
ЦГД - 1,4-циклогексадиен,
ЭА - этилацетат,
ТФУ - трифторуксусная кислота,
ДМФ - диметилформамид,
Z - карбобензокси. Контроль за синтезом пептидов проводят на пластинках марки "Силуфол" при опрыскивании раствором нингидрина в системах растворителей:
1-бутанолуксусная кислота - вода 5:1:2;
хлороформ-метанол 14:1;
н-бутанол - уксусная кислота - пиридин-вода 30:6:20:24;
хлороформ - метанол-аммиак 6:4:1;
изобутанол - ацетон - 12% аммиак;
изопропанол - муравьиная кислота - вода 20:1:5. Все растворители абсолютируют соответствующим образом. Точки плавления не корректируют. Целевой продукт после отщепления защитных групп подвергают кислотному расщеплению кипячением в 6н. HCl в течение 48 ч и затем исследуют в системах растворителей 5 и 6 двухмерной хроматографией (fingerprint). В продукте гидролиза обнаружены все аминокислоты, входящие в состав пептида. Для очистки и определения гомогенности гептапептида использована высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ) на оборудовании фирмы Du Pont (США), хроматограф, модель 850, колонка Zorbax ODS, длиной 250 мм и диаметром 4,6; 9,4 и 21,2 мм, спектрофотометрический УФ-детектор (190-350 мм). Спектр кругового дихроизма получают на спектрополяриметре Carry-60 с приставкой CD 001 при продувании оптической части прибора азотом. Оптическое вращение измеряют на цифровом поляриметре марки "Perkin Elmer". Спектральную характеристику конечного защищенного пептида и целевого продукта получают на спектрофотометре "Unicam SP 800" в пределах длин волн 250-350 нм. П р и м е р 1. Получение гептапептида. 1. Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонилпропилглицилпролина. 0,930 г (4,3 моль) Boc-pro растворяют в 25 мл ТГФ, добавляют 0,580 г (4,3 ммоль) БТ, охлаждают до 0оС и добавляют 0,970 г ДЦГК в 10 мл ТГФ. После перемешивания в течение 20 мин при охлаждении добавляют раствор бензилового эфира ТФА глицил-пролина 1,61 г (4,3 ммоль) в 5 мл ТГФ и 0,6 мл (4,3 ммоль) ТЭА. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при 0оС и сутки при комнатной температуре, затем отфильтровывают ДЦМ, раствор упаривают в вакууме; остаток растворяют в 250 мл ЭА. Этилацетатный раствор промывают 0,1 н. раствором HCl, водой, 5%-ным раствором NaHCO3, Н2О, а затем высушивают над MgSO4 и упаривают в вакууме. Оставшееся масло растворяю в эфире и переосаждают гексаном. Вязкое масло растирают с эфиром и после выдерживания в холодильнике в течение ночи отфильтровывают осадок и высушивают в вакууме. Выход 1,350 г (68%). Т.пл. 120-122оС; Rf=0,65 (1); 0,74 (2). 2. Бензиловый эфир трет-бутилоксикарбонил (NO2 
) аргинил-пролил-глицил-пролина. А) 0,966 г Boc Pro Gly Pro Bzl суспендируют в 6 мл СН2 Cl2, добавляют 6 мл трифторуксусной кислоты (ТФУ) и выдерживают 30 мин при комнатной температуре, затем упаривают в вакууме при 25-30оС, многократно упаривают с абс. метанолом с абс. эфиром, затем заливают абс. эфиром и отделившийся осадок после декантации эфира высушивают в вакууме. Выход 0,95 г (2 ммоль); Rf=0,01 (1); 0,085 (2). Б) Boc (NO2 
) Atg 0,638 г (2 ммоль) растворяют в 10 мл ТГФ и 2 мл ДМФ, добавляют 0,27 г (2 ммоль) БТ, охлаждают до 0оС, и добавляют 0,46 г (2,2 ммоль) ДЦГК. После перемешивания в течение 40 мин при охлаждении, добавляют раствор 0,95 г (2 ммоль) ТФА Pro-Gly-Pro Bzl в 10 мл ТГФ и 0,28 мл (2 ммоль) ТЭА. Перемешивают реакционную смесь в течение трех суток. Отфильтровывают осадок ДЦМ, упаривают раствор в вакууме, а к остатку приливают 150 мл гексана, при этом отделяется целевой продукт в виде масла, которое растворяют в 200 мл ЭА и обрабатывают как на стадии 1. Выход 0,902 г (85%). Т.пл. 108-110оС;
[
]D22 - 77,8o (C=0,5, AcOH);
Rf 0,44 (1); 0,80 (3). 3. Бензиловый эфир трет-бутилоксикарбонил-пролил-аргинил
(NO2 
) пролил-глицил-пролина. А) 0,982 г (1,63 ммоль) суспензируют в 4 мл CH2Cl2, добавляют 4 мл ТФУ и выдерживают 45 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме при температуре 25оС. Остаток упаривают несколько раз с абс. EtOH, затем с абс. эфиром, далее при добавлении абс. эфира выпадает осадок, который промывают декантацией абс. эфиром и затем высушивают в вакууме. Выход количественный. Rf 0,16 (1); 0,0 (2); 0,27 (3). Б. Boc-pro 0,352 г (1,63 ммоль) растворяют в 5 мл ТГФ, добавляют 0,22 г (1,63 ммоль) БТ, охлаждают до 0оС и добавляют 0,37 г ДЦГК в 10 мл ТГФ. Через 40 мин к реакционной смеси добавляют раствор ТФА Arg(NO2 
) - Pro-Gly-ProOBzl (1,63 ммоль) в 10 мл ТГФ и 0,230 мл (1,63 ммоль) ТЭА. Перемешивают 2 ч при 0оС и двое суток при комнатной температуре, затем отфильтровывают осадок ДЦМ, упаривают в вакууме, растворяют в 100 мл ЭА и обрабатывают аналогично стадии 2 Б. Выход 840 мг (67,8%). Т.пл. 147-148оС;
Rf - 0,42 (1); 0,31 (2); 0,72 (3)
[]D22=-66,0o [C=0,5; AcOH]. 4. Пентафторфениловый эфир трет-бутилоксикарбонил- 
-карбобензоксилизина (Boc-Lys (Z) PFP). К Boc-Lys (Z) 0,76 г (2 ммоль) в 5 мл абс. ЭА добавляют 0,50 г (2,7 ммоль) пентафторфенола, охлаждают до 0оС и добавляют 0,50 г (2,4 ммоль) ДЦКГ в 10 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при 0оС, отфильтровывают ДЦМ, упаривают раствор в вакууме, добавляют 5 мл абс. эфира и 25 мл гексана, постепенно при охлаждении отделяется осадок, который отфильтровывают и высушивают в вакууме. Выход 0,454 г (87%). Т.пл. 117-120оС;
Rf 0,84 (1); 0,91 (2). 5. Бензиловый эфир трет-бутилоксикарбонил-лизил-[ -карбобензокси]-пролил-аргинил (NO2 
)-пролил-глицил-пролина. А. Boc-Pro-Arg (NO2 
)-Pro-Gly-Pro OBzl. 0,84 г (1,1 ммоль) в 3 мл СН2Cl2 и 3 мл ТФУ обрабатывают как на стадии 3, А. Выход 0,813 г (1,07 ммоль, 97%); Rf 0,095 (1). 5. КТФА - Pro-Arg (NO2 
)-Pro-Gly-Pro OBzl. 0,813 г (1,07 ммоль), растворенного в 10 мл ТГФ и охлажденного до 0оС, прибавляют при перемешивании 0,15 мл ТЭА и затем в течение 2 ч четырьмя порциями Boc-Lys (Z) PFP 0,585 мг (1,07 ммоль). После перемешивания трое суток при комнатной температуре реакционную смесь упаривают в вакууме, остаток растворяют в 60 мл ЭА и обрабатывают как на стадии 1. Выход 0,60 г (58%). Т.пл. 130-132оС. Rf 0,38 (1); 0,75 (3). []D22 - 86,2o (c 0,5; Ac OH). 6. Бензиловый эфир трет-бутилоксикарбонил-треонил-лизил-(-карбобензокси)-про- лил-аргинил-(NO2 
)-пролил-глицил-пролина. А) Boc Lys-(Z 
)-Pro-Arg (NO2 
)-Pro-Gly-Pro OBzl. 0,69 г (0,69 ммоль) в 2 мл CH2Cl2 и 2 мл ТФУ обрабатывают как на стадии 3 А. Выход: количественный. Rf 0,12 (1); 0,45 (3). Б) К ТФА Lys (Z 
)-Pro-Arg(NO2 
) -Pro-Gly-Pro OBzl. (0,69 ммоль) в 30 мл ТГФ при охлаждении до 0оС прибавляют 0,097 мл ТЭА и 0,266 г Boc Thr PFP, полученного как на стадии 4. Далеe синтезируют целевой продукт как на стадии 5, Б, добавляют в процессе реакции ТЭФ до рН 6-7. Выход 0,616 г (80%). Т.пл. 155-156оС;
Rf 0,39 (1); 0,145 (2); 0,80 (3); 0,96 (4);
[]D22 - 79,2o (c=0,5; Ac OH). 7. Трет-бутилоксикарбонил-треонил-лизил-пролил-аргинил-пролил-глицил-пролин. 0,170 г (0,152 ммоль) Boc-Thr-Lys (Z)-Pro-Arg (NO2 
) Pro-Gly-Pro OBzl кипятят в 3 мл абс. EtOH и 4 мл 1,4-циклогексадиена в течение 4-5 ч в присутствии 55 мг Pd-черни (контроль - хроматографирование на пластинках "Силуфол", далее спектрофотометрический анализ выделенного вещества на отщепление NO2 
группы как наиболее трудно отщепляемой каталитическим восстановлением), катализатор отфильтровывают, многократно промывают этанолом. Объединенный фильтрат упаривают досуха, а остаток дважды переосаждают из MeOH-эфиром. Выход 106,4 мг (94% Rf=0,125 (1); 0,37 (3), 0,57 (4); []D22 -75,6o(c= 0,25; Ac OH). 8. Треонил-лизил-пролил-аргинил-пролил-глицил-пролина. 90,4 мг Boc-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro суспензируют в 1,5 мл 2н. HCl (диоксан и выдерживают при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем добавляют сухой эфир, упаривают в вакууме, опять добавляют сухой эфир и промывают осадок несколько раз декантацией сухим эфиром. Переосаждают из MeOH-эфиром. Полученный осадок (86 мг) растворяют в 1,5 мл 30%-го EtOH и наносят на колонку (V= 1 мл) Амберлист А-21 (АсО-форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат. Элюируют пептил 
30-40 мл. 30%-го EtOH, упаривают в вакууме досуха и высаждают из метанола - эфира. Выход 65 мг (75%);
Rf 0,01 (1); 0,22 (4); 0,10 (3);
[]D22 =-62,8o (c=0,25; AcOH). Аминокислотый анализ: Thr 0,9 (1); Lys 0,98 (1); Pro 2,78 (3); Arg 1,0 (1); Gly 1,1 (1). Дальнейшую очистку полученного пептида производят высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ). Градиент растворитель B 0-60% за 60 мин [растворитель А: 0,01 М CH3COONH4, рН 4,0, растворитель В: 0,01 М CH3COONH4 (А) в MeOH], 50oC, скорость потока 4 или 10 мл/мин для колонок диаметром 9,4 и 21,2 мм соответственно. Аналитическая хроматография растворитель А: 0,05 М NH4H2PO4 (pH 4,0); растворитель В: MeOH, градиент растворителя В 0-50% за 50 мин, 50оС, скорость потока 1 мл/мин, колонка диаметром 4,6 мм. Спектр кругового дихроизма получен на спектрополяриметре Carry-60. Концентрация пептида 0,1 мг/мл Н2О, шпала - 0,1о, скорость скопирования 5 нм/мин, разрешение щели 15 
. Проведены биологические испытания описываемого гептапептида. Исследуемые пептиды вводят внутрибрюшинно в водном растворе самцам нелинейных белых крыс (массой 250 г) и мышей (массой 20 гр) за 7, 14, 30 мин до эксперимента. Контрольным животным вводят таким же образом дистиллированную воду в том же объеме. 1. Излучение действия пептидов на реализацию поведения - избавления крыс от стрессогенной ситуации. Крыс, предварительно разделенных на группы по характеру эмоционального реa - гирования (1-неэмоциональные, 2-эмоциональные) помещают в цилиндр с водой. Избегание может быть осуществлено путем подныривания под стенки цилиндра. Регистрируют следующие показатели: латентный период (bc), реализацию поведения избавления, количество ошибок (незавершенные попытки подныривания), характер эмоционального реагирования, общую длительность стимулирующего действия. Гептапептид в широком диапазоне доз (70-1200 мкг/кг) уменьшал, а в дозах 900-1000 мкг/кг полностью устранял ошибки в реализации поведения избавления крыс 2 группы. Латентный период реализации избегания сокращался в 30 и более раз. Наблюдался дозо-зависимый эффект. Оптимизирующее действие на поведение избавления крыс 1-й группы (неэмоциальные) развивалось на фоне больших доз (1000-1200 мкг/кг). Эффект сохранялся в пределах 60-90 мин. Тетрапептид тафцин оказывал сходное, но кратковременное (15 мин) действие, без дозо-зависимого эффекта и вне связи с типом эмоционального реагирования. 2. Изучение действия пептидов на поведение "отчаяния" (отказ от деятельности, иммобилизации) принудительно плавающих мышей. Мышей помещают в замкнутый цилиндр с водой без возможности избегания. Оценивают длительность сохранения неподвижной позы на воде (иммобилизация) за различные отрезки времени 6, 12, 30 мин). Гептапептид резко сокращал период иммобилизации. Эффект сохранялся во все регистрируемые интервалы времени. Тафцин был эффективен только в первые 4-6 мин и в узком диапазоне доз. Результаты приведены в табл. 1. Данные свидетельствуют, что психостимулирующее действие гептапептида превосходит тафцин по интенсивности в 3 раза, по диапазону эффективных доз в 1,5 и длительности действия в 3-4 раза. 3. Изучение иммунотропной активности пептидов. Изучалась фагоцитарная активность в однослойной культуре мышечных перитониальных макрофагов с использованием в качестве объекта фагоцитаза Salm. thyphimurium, а также в мазках крови больных со сниженным антителогенезом. Показано, что гептапептид увеличивает фагоцитарную активность макрофагов на 19% , превосходя тафцин на 9%. Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) возрастает в 1,5 раза сильнее, чем на фоне тафцина. Количество фагоцитарно активных клеток увеличивается на 50% (табл. 2). Показатель завершенности фагоцитоза:
ИФ - 
определена токсичность описываемого гептапептида. Эксперимент выполнен на 30 подопытных животных (мышах) массой 20 г при внутрибрюшинном введении гептапептида в дозах 0,5; 5; 50 мг/кг, т.е. в 10, 100, 1000 раз превышающих эффективную. Наблюдения проводят через 60 ми после введения в тот же день и ежедневно в течение последующих 5 дней. Ни в одном случае не обнаружено токсического эффекта, определяемого по боковому положению и миролаксирующему действию. При вскрытии животных отрицательного влияния на структуру внутренних органов не обнаружено. Установлено, что описываемый гептапептид не оказывает токсического действия на животных в дозе, превышающей эффективную (0,05 мг/кг) в 1000 раз. Проведенные исследования позволяют сделать вывод, что описываемое соединение превосходит тафцин по длительности психостимулирующего действия в 3-4 раза, по интенсивности - в 3 раза, по диапазону эффективных доз - в 1,5 раза и по показателям завершенности фагоцитоза - в 1,5 раза. При этом описываемое соединение малотоксично. Все это позволяет предположить возможность его использования в биологии и медицине в качестве психостимулятора пролонгированного действия, обладающего иммунотропной активностью.
Формула изобретения
Thr - hys - Pro - Arg - Pro - GLy - Pro, обладающий свойствами психостимулятора пролонгированного действия с иммунотропной активностью.
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2
