Способ получения адсорбента для аффинной хроматографии

Авторы патента:

C08J5/20 - изготовление сформованных структур ионообменных смол

B01J20/30 - способы получения, регенерации или реактивации

СПОСОБ ПОЛУЧЕНШ АДСОРБЕНТА ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ путем модифицирования полимера-носителя, содержащего сложноэфирные группы, первичным амином, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса получения адсорбента и повышения селективности его биоспецифического действия, модифицирование полимера-носителя осуществляют обработкой расплавом первичного аъшна при температуре, не превышающей температуру разложения носителя. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (1 Ц

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ.(21) 3528615/23-05 (22) 29. 12.82 (46) 23.10.85. Бюл. Р 39 (72) Е.К.Тарасов, В.С.Лысенко и Г.A.Êosaëåí (71) Новочеркасский ордена Трудового

Красного Знамени политехнический институт им.Серго Орджоникидзе и Ростовский государственный университет им.Г1.Суслова (53) 661.183.123(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

9 520370, кл. С 08 Г 8/00, 1976.

2. Ja Turkova. Immobilization of

enzymes on Hydroxyalkylmethacrylate

Gels, вЂ” Methods in Enzymology, 1976, ч. 44, р. 76-77. (51)4 В 01 J 20/30, С 08 F 8/32, С 08 J 5/20 (54) (7) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА

ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ пУтем моди. фицирова»ия полимера-носителя, содержащего сложноэфирные группы, первич»ым амином, о т л и ч а .ю шийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса получения адсорбента и повышения селективности его биоспецифического действия, модифицирование полимера-носителя осуществляют обработкой расплавом первичного амина при температуре, »е превышающей температуру разложения носителя.

118б243

Изобретение относится к биологической химии, а именно к способам получения адсорбентов для аффинной хроматографии, которые могут быть использованы при исследованиях, полу- 5 чении и анализе белков и различных .биологически активных веществ, а также в медицинской, фармацевтической, микробиологической и пищевой промышленности для выделения, очистки и им-1О мобилизации антител, антигенов ферментов,их субстратов, других белков и низкомолекулярных веществ.

Известен способ получения адсорбентов для биоспецифической хроматографии, заключающийся и образовании химической пространственной группы ("ножки") путем взаимодействия исходного носителя с ннертныин водорастворимыми полпсахарндами, содержащими 2б функциональные группы, обеспечивающими ковалентное связывание пространственной группы с носителем, активации полисахаридов бромцианом и послецующего присоединения аффинного лиганда к 25 носителю через активированную пространственную группу 1).

Недостатками этого способа являются Сложность технологии, высокая стоимость исходных реагентов, необходимость применения высокотоксичных веществ (бромциана), возможность неспецифичного взаимодействия за счет

1 образования N,N --замещенных гуанидинов.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения адсорбента для,аффинной хроматографии, заключающийся в модификации "Сферона" (полиоксиалкилметакрилата) путем обработки его поверхности водным раствором бромциана при рН 11 и охлаждении льдом с последующей промывкой и обработкой водным раствором связываемого вещества, содержащего аминогруппу, при рН 9,0 и комнатной температуре в течение нескольких часов (2 ).

Недостатками известного способа являются сложность процесса модификации, предусматривающего строгое 5О поддержание рН реакционной смеси, высокая токсичность используемьгл реактивов (бромциана), что вызывает необходимость применения ряда мер предосторожности, усложняющих процесс 55 модификации, пониженная биоспецифичность получаемых адсорбентов, обусI ловленная образованием N N -дизаме щенных гуанидинов, несущих положительные заряды и действующих в определенных условиях как детергенты, в результате чего возникает неспецифическая сорбция и возможна денатурация разделяемых белков.

Цель изобретения вЂ” упрощение технологии процесса получения адсорбента и повышение селективности его биоспецифического действия.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения адсорбента для аффинной хроматографии путем модифицирования полимера-носителя, содержащего сложноэфирные группы, первичным амином, модифицирование полимера-носителя осуществляют обработкой распланом первичного амина при температуре, не превышающей температуру разложения носителя.

Сущность предлагаемого способа заключается в термохимической модификации исходного носителя полиэфирной природы первичным амином„ в результате чего происходит аминолиз части сложноэфирных групп, в то время,как сущность известного способа состоит в предварительной активации исходного носителя водным раствором бромциана, приводящей к образованию на нем цианатных групп, последующей обработке водным раствором гексаметилендиамина при комнатной температуре, в результате чего возникает гуанидиновая структура.

В качестве полимера-носителя могут использоваться любые полимеры со сложноэфирной группой, в частности эфиры полиакриловых кислот, лоперечно сшитые этиленгликолевые эфиры дикарбоновых кислот.

В качестве аминов используют первичные моно- и диамины.

Пример 1. Перегоняют гексаметилендиамин при нормальном давлении и добавляют к расплаву 5 вес.ч. гексаметилендиамина, 2 вес.ч. сухого адсорбента вЂ” полиоксиалкилметакрилата "Сферон-1000" с размером частиц б0-100 мкм. Смесь нагревают в колбе о с обратным холодильником при 205 С в течение времени, определяемого необходимым количеством аминогрупп в конечном продукте. В данном примере кипячение смеси производят в течение

1,5 ч. Переносят реакционную смесь в воронку со стеклянным фильтром, установленную в колбе Бунзена, и промыз 11862 вают ее последовательно 20 объемами воды, 5 объемами ацетона и 5 объемами диэтилового эфира.

Полученный препарат высушивают при комнатной температуре и осуществляют качественный и количественный анализ полученного адсорбента стандартными методами.

Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1 sa исключением того, что в качестве полимера используют полиэтиленгликольадипинат и обработку ведут 10 мин.

Количественный анализ полученных адсорбентов проводят с помощью нингид 15 ринового реактива и осуществляют непрямым иодатометрическим способом.

Для этого к 10 мг сухого адсорбента добавляют 2 мл раствора НС1 (20 мкгэкв/мл) и инкубируют смесь в течение 2б о

5 мин при 25 С и при легком перемешивании. Далее суспензию отстаивают и по 1 мл жидкости, находящейся над осадком, переносят во флаконы, куда затем добавляют по 1 мл смеси 1%-ного2

ИаЗ и 1Х-ного K30 . Выделившийся йод титруют 0,01М раствором тиосульфата натрия. Рассчитывают количество свя занной с адсорбентом кислоты и по нему судят о содержании аминогрупп в адсорбенте. При этом учитывают также результаты контрольного титрования немодифицированного адсорбента.

Присоединение аффинного лиганда к модифицированным адсорбентам, полу35 ченным по известному и предлагаемому способам, проводят методом карбодиимидного связывания.

В качестве аффинного лиганда используют и -анисовую кислоту. Полу40 ченный предлагаемым способом биоспеци фический адсорбент успешно используют для выделения анизолсвязывающеro белка обонятельного эпителия собаки согласно методу Прайса.

Количество неспецифически связавшегося с адсорбентом белка определяют путем его элюирования из хроматографической колонки раствором 5М мочевины и ЗМ NaC1 и измерения ультрафиолетового поглощения элюата проточной кюветой "Увикорд".

Пример 3. В качестве исходных адсорбентов используют полиоксиалкилметакрилат типа "Сферон-300" и попе- 55 речно сшитый полиэтиленгликольтерефталат. Модифицирующим реактивом служит путресцин (1,4-диаминобутан).

43 4

Модификацию известным и предлагаемым способами, а также количественный и качественный анализ полученных адсорбентов проводят аналогично примеру 1, но при температуре расплава

160 С.

Пример 4. Осуществляют аналогично примеру 3 за исключением того, что в качестве полимера используют полиэтиленгликольтерефталат и обработку ведут 10 мин.

Пример 5. В качестве исходного адсорбента используют "Сферон1000". Модифицирующим реактивом служит бензиламин, который в данном случае является и аффинным лигандом.

Модификацию адсорбента предлагаемым способом осуществляют аналогично примеру 1.

Концентрацию бензиламина на полученном аффинном адсорбенте определяют методом исчерпывающего сульфирования.

Полученные данные процесса модификации адсорбентов приведены в таблице.

Приведенные в таблице результаты подтверждают повышение биоспецифичности адсорбента, неспецифическое связывание белка с которым уменьшилось в 4 раза (с 0,4 мг белка/г сухого адсорбента до О, 1 мг белка/г сухого адсорбента), и расширение количества типов адсорбентов, пригодных для использования в аффинной хроматографии (в частности поперечно сшитый полиэтиленгликольадипинат). Количество биоспецифически связанно о белка при использовании адсорбентов по известному способу и примеру 1 составляет 14 мкг/мл геля.

Изменяя время термохимической обработки исходного адсорбента модифицирующим реагентом, можно варьировать концентрацию аффинного лиганда в широких пределах, что позволяет точно регулировать свойства получаемого аффинного адсорбента.

Таким образом, варьируя типы адсорбентов, типы первичных аминов и время модификации, можно получать, реализуя предлагаемый способ, широкий спектр адсорбентов для аффинной хроматографии с заранее заданными свойствами.

Преимуществами предлагаемого способа получения адсорбента для аф1186243 ный бент

Концентрация NH

2 групп, полученных на адсорбенте (мкг-экв/

/1 г сухого адсорбента) Условия обработки амином

Условия обработки 13rCN

Количество неспецифически связанного белка (мг белка на

1r сухого адсорбента) "Сферон1000"

Известный

10 мин рН 11

Т=5 С

5Е-ный водный раствор, pH9,2ч

194

0,4

i0 мин рН 11

T=5 С

Известный (2), ПоперечТо же но сшитый полиэтиленгликольадипинат

Предлагаемый по примеру 1 Сферон1000" расплавом, отсутств. 1,5 ч.

T-205 С

300

0,1

ПоперечРасплано сшитый поливом

10 мин

Т вЂ” 205 С этиленгликольадипинат

260

2,3 финной хроматографии по сравнению с известным являются простота технологии, осуществляемой в одну стадию, включающую в себя кипячение реакци5 онной смеси беэ контроля. и поддержания pk1, промывку и сушку полученного продукта, в то время, как при реализации известного способа необходима предварительная обработка исходно- 1 го адсорбента токсичным бромцианом, повышенная биоспецифичность получаемого адсорбента, определяемая образованием амидной-связи в процессе .аминолиэа сложных эфиров и являющаяся связывающим звеном между исходным адсорбентом и "ножкой" (или аффинным лигандом). Образованная аминная связь, являясь электропейтральной и гидрофильной, не оказывает денатурирующего воздействия на разделяемые белки и не снижает специфичности их сорбции, в то время, как в известном способе вместо амидной связи образуется N,N --дизамещенная иэомочевинная

1 группировка, несущая положительный заряд и обладающая свойствами детергента, безопасность технологии, определяемая отказом от использования крайне токсичного бромциана, сравнительно низкая стоимость получаемого продукта и возможность получения адсорбента многоцелевого применения эа счет возможности регулирования числа присоединенных активных групп, что важно при протекании ряда хроматографических процессов.

Промышленное производство модифицированных адсорбентов на базе "Сферона" по предлагаемому способу, учитывая их высокое качество и дос гаточно низкую стоимость, позволяет исполь. зовать их в некоторых отраслях пищевой, фармацевтической и микробиологической промышленности, где ранее использование аффинных адсорбентов было вообще невозможно из-эа их высокой стоимости.

1186243

Известный

$2) "Сферон300"

215

326

4 Поперечно сшитый полиэтиленгликольтерефталат

233

Составитель В.Икртычан

Редактор M.Áëàíàð Техред Т.Дубинчак Коррекор В.Сирохман

Заказ 6466/8 Тираж 540 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, )К-35, Раушская наб., д.4/5