Способ определения фоксима в секционном материале

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОКСИМА В СЕКЦИОННОМ МАТЕРИАЛЕ путем извлечения его из пробы н-гексаном в присутствии безводного сульфита натрия, экстракционного перераспределения в системе н-гексан - диметилформамид с последующим хроматогра даческим анализом в тонком слое кремниевой кислоты, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, хроматографи ческий анализ осуществляют на пластинах Силуфол, импрегированных 60%-ным pacTBolDOfi диметилформамида в метаноле и н-гексане, насыщенном диметилформамидом,

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

09) (И), 1, 1)) 4 С 01 N 33/48 ф Г;" ..

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 :: . Ы

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ (21) 3788234/28 14 (22) 19.07.84 (46) 07.12.85. Бюл. 1) 45 (71) Ордена Трудового Красного

Знамени научно«исследовательский институт судебной медицины (72):Н.А. Горбачева и A.М. Орлова (53) 616.07 (088.8) (56) Письменная М.В. К анализу фосфорорганических пестицидов хроматознзимным методом в продуктах питания и биосубстратах. - Вопросы питания, 1981, 1) 1, с. 69-71.

Горбачева Н.А. Изолирование и обнаружение байтекса при судебно-химическом анализе биологического материала - Фармация, 1983, 11 2, с. 32-42. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОКСИИА

В СЕКЦИОННОМ МАТЕРИАЛЕ путем извле- . чения его из пробы н-гексаном в при сутствии безводного сульфита натрия, экстракционного перераспределения в системе н-гексан - диметилформамид с последующим хроматографическим анализом в тонком слое кремниевой кислоты, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, хроматографический анализ осуществляют на пластинах "Силуфол", импрегированных

60Х-ным раствором диметилформамида в метаноле и н-гексане, насыщенном диметилформамидом.

Ф

Изобретение относится к химическому анализу секционного материала для обнаружения в нем фосфорорганического инсектицида фоксима 0,0 диэтилтиофосфорил-0-(альфа-цианобенз-I альдоксим) при судебно-медицинской экспертизе острых отравлений.

Цель изобретения — повышение

1 чувствительности способа.

Способ осуществляется следующим образом. для изолирования фоксима к 25 г средней пробы измельченного органа (печень, почки, желудок„ кишечник ) в колбе вместимостью 200-250 мл с притертой пробкой добавляют 50 мл н-гексана, 25 г безводного сульфата натрия и оставляют на 12 ч при периодическом перемешивании. Жидкость отфильтровывают в колбу отгонки расрастворителя. Остаток в колбе вновь заливают 50мл н-гексанаи извлекают при периодическом взбалтывании в те. чение 2 ч. Извлечение отфильтровывают и присоединяют к основному, Операцию повторяют. Растворитель отгоняют на ротационном вакуумном

I испарителе при 25-30 Ñ до объема

10-. 12 мл.

С целью отделения основной массы . балластных веществ пРоизводят экстрак; ционную и хроматографичеакую очистку, и делительную воронку Р1 вместимостью 75-100 мл с помощью н-гексана переносят сконцентрированное до

10-20 мл извлечение из биологическо-. го материала так, чтобы объем гексановой фазы составил 25 мл. В делительную воронку наливают 25 мл диметилформамида (ДИФА ), насыщенного н-гексаном, и экстрагируют при энергичном вэбалтывании 3 мин. Нижнюю фазу ДИФА переносят в делительную воронку Ф2 вместимостью 75-100 мл, содержащую

25 мл н-гексана, насыщенного ДИФА.

В делительную воронку 91 добавляют

25 мл ДИФА, насыщенного н-гексаном.

Содержимое делительных воронок 111 и .

2 взбалтывают 3 мин. После разделения слоев из делительной воронки

92 ДИФА переносят в делительную воронку ФЗ вместимостью 500 мл, содержащую 40 мл 12Х-ного раствора хлорида натрия, а из делительной воронки ll 1 " в делительную воронку У2. В делитель ную воронку У1 добавляют 25 мл ЛИФА

19б772 2 насыщенного н-гексаном. Содержимое воронок 91 .и 2 взбалтывают 3 мин, Слой ДИФА из воронки Р2 переносят в воронку УЗ, а из воронки 91 - в воронку У2. Гексановую фазу в воронке В1, содержащую экстрактивные вещества, отбрасывают. Взбалтывают содержимое делительной воронки 11 3

3 мин, по разделении слоев ДИФА из19 влечение отделяют н присоединяют к экстракуту в воронке УЗ. Гексановую фазу в воронке У2, содержащую экстрактивные вещества, отбрасывают. Содержимое воронки УЗ осторожно перемешивают, при этом отделяется слой н-гексана.

Добавляют 10 мл н-гексана и реэкстрактируют фоксим взбалтыванием в течение

3 мине

После разделения слоев нижнюю

20 водную фазу отделяют в колбу вмести,мостью 50 мл, гексановую фазу переносят в делительную воронку 11 4 вместимостью 75-100 мл, содержащую 50 мл 123-ного раствора хлорида натрия, 25 Раствор из колбы переносят в делительную воронку 93 стенки промывают

10-15 мл 123-ного раствора хлорида натрия и присоединяют к Раствору в делительиой воронке 93. Водную фазу

30 экстрагируют еще двумя порциями н-гексана по 10 мл. Гексановые извлечения. переносят в делительную воронку 94, взбалтывают с раствором хлорида натрия. Верхнюю гексановую фазу отделяют и переносят в колбу вместимостью 50 мл с 7-10 г безводно.

ro сульфата натрия.Делительную воронку.ll 4 промывают 5-8 мл и н-гексана, присоединяют раствор к основному

40 извлечению. Через 30 мин гексано= вое извлечение декантируют в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят н-гексаном до метки, перемешивают.

Хроматографическую очистку

45 производят следующим образом.

25 мл полученного гексанового раствора, соответствующие 12,5 r исследуемого органа, выпаривают при комнатной температуре до объема

0 5-1 мл. С помощью стеклянного капилляра, используя для смыва бензол, раствор переносят в виде полосы длиной 6,5-7 см на стартовую линию хроматографической пластинки с закрепленным слоем кремневой кис. лоты, Стеклянные пластины 13 18 см изготавливают способом поливки по прописи иэ расчета на 1 см: кремне2

3 . ) вой водой кислоты (150 меш ) 0,026 r, гипса (150 меш ) 0,0013 r, дистиллированной воды 0,06 мл. Пластинки сушат при комнатной температуре 12 ч.

При перегрузке сорбента, что иногда наблюдается при исследовании объектов с большим содержанием жира, для препаративной хроматографической очистки используют меньшую аликвоту исследуемого раствора, например соот. ветствующую 6-8 г органов.

На стартовую линию той же пластинки на расстоянии не менее 2 см от края пластинки и 2,5-3 см от края . полосы исследуемого извлечения наносят в виде пятна диаметром 1-2 мм раствор фоксима в бензоле (метчик ) в количестве 10-12 мкг в пятно. Через 10 мин хроматографируют в систе ме бенэол. Фронт растворителя

14-14,5 см, время хроматографирования 30-40 мин. При этом фоксим (Rf 0,47-0,60) отделяется от экстрактивных веществ (Rf 0,70-0,95). Орга-. нический растворитель удаляют при комнатной температуре 15-20 мин.

Часть хроматограммы, соответствующую полосе исследуемого раствора, защищают стеклянной пластинкой, а открытую часть с метчиком опрыскивают палладиевым реактивом. Через

15-20 мин обнаруживается пятно мет-, чика. . Из защищенной части пластинки, соответствующей расположению метчика, делают соскоб сорбента в виде прямоугольной полосы шириной 4 см (по

2 см в обе стороны от центра проявленного метчика ). Соскоб переносят в стеклянную хроматографическую колонку (внутренний диаметр 1,5 см ), на дно которой предварительно помещают небольшой тампон ваты, и элюнруют 50 мл смеси н-гексана - ацетон

1:1, добавляя порциями по 5-8 мл и обмывая стенки колонки. Элюат коли чественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл с помощью н-,гексана и объем раствора доводят до метки тем же растворителем. Аликво ты раствора исследуют.

196772 4 циями, описанными ниже в пунктах а или б, в и r ) при сравнении Rf исследуемого вещества с Rf фоксимаметчика (Внешний стандарт ); исследование в системе бенэол может быть проведено и иа пластинках "Силуфол" в сочетании с хромогенными пробами., описанными в пунктах а {или б )и в;

П. на пластинках "Силуфол", им

10 прегнированных 603-ным раствором

ДЕФА в метаноле в системе н-гексан, насыщенным ДИФА. Обнаружение фоксина осуществляют палладиевым реактивом (пункт в ). Разделение. проводят !

5 при использовании внутреннего мет- . чика-фоксима.

При исследовании реакциями с палладиевым, бромфеноловым синим, 4-НБП реактивами и пробой на органи-, 20 чески связанный фосфор, возможно проявление пятен экстрактивных веществ, но они отличаются от фоксима по величине Rf.

Хроматографическое исследование

25 проводят следующим образом;

1. Аликвоты элюата, эквивалент.ные 2 г органов (для обнаружения палладиевым и 4-НБП реактивами ) и

2,5 г органов (для реакции обнаружеj0 ния по фосфору и с бромфеноловым синим реактивом ), наносят после предварительного удаления избытка растворителя на стартовую линию хроматографических пластинок с тонким

35 слоем силикагеля КСК (стеклянные пластинки Зх)8 см изготавливают спо- собом поливки по прописи иэ расчета на 1 см : силикагеля КСК (150 меш)

0,013 г, гипса (150 меш ) 0,0007 r, 40 ДистиллирОваинОи ВОДЫ 0 03 мл1 плас тинки активируют при 110 С в течение 1 ч в виде пятен диаметром

0,3"0,5 см, Для перенесений остатков . используют бензол. Растворы наносят на пластинку с помощью стеклянных капилляров. На расстоянии не менее

2 см исследуемых пятен наносят пятно метчика (раствор фоксима в бензоле 3-5 мкг в пятно ). Хроматограмму развивают в системе бензол. Фронт растворителя )414,5 см. Растворитель удаляют при комнатной температуре в течение не менее 30 мин и проводят реакции обнаружения Ы фоксима 0,45-0,60.

Хроматографическое исследование проводят последовательно в двух системах1. на пластинках силикагеля КСК в системе бензол при проявлении хромогенными реактивами на различными функциональные группы фоксима (pea а. Обнаружение палладиевым раствором: хроматограмму Опрыскивают реактивом (водный раствор 5Х-ного

S 1196772 6 хлорида -палладия, содержащий 5 мл концентрированной соляной кислоты в 100 мл раствора, перед употреб.лением реактив разбавляют этанолом

1:12 ). Пятна желто-коричневого, коричневого или бурого цвета (в зависимости от количества фоксима ) проявляются через 15-20 мин, при относительно больших количествах вещества, а при близких к границев течение 24 ч, б. Обнаружение бромфениловым синим реактивом: хроматограмму опрыскивают бромфениловым.синим реактивом (смесь 2%-ного раствора нитрата серебра в воде и 0 4Х-ного раствора бромфенилового синего в о ацетоне 1:1,. нагревают при 50 С

1О мин ). По охлаждении опрыскивают 5%-ным раствором уксусной кис- 20 лоты. Появляются пятна синего цвета на желтом фоне, в. Обнаружение 4-НБП (4- и-нитробенэил )пиридин ): пластинку опрыски вают до увлажнения 2Х-ным ацетоно- 25 вым раствором 4-НБП, затем, избегая сильного увлажнения, 20%-ным раствором карбоната аммония, разбавленным ацетоном 1:1, нагревают в сушильном шкафу при 120 С 10 мин, охлаждают, опрыскивают 10%-ным раствором гидроксида натрия в 50%-ном этаноле.

На белом фоне появляются фиолетовосиние пятна, постепенно обесцвечивающиеся, Сразу же отмечают проявлен ные зоны.

r, Обнаружение по фосфору: хроматограмму (в камере для опрыскивания под тягой ) опрыскивают, избегая полного увлажнения, раствором хлорной 40 и соляной кислот в присутствии молибдената аммония реактив Ó1 для обнаружения по фосфору: к )Х-ному раствору молибдата аммония в 0,1 М растворе соляной кислоты добавляют 5% . 4S хлорной .кислоты 57% и нагревают при 230-250 С в течение 60 мин (под тягой ) в сушильном шкафу. По охлаж-, дении пластинку опрыскивают реактивом В2 5 г молибдата натрия (На Мо01 Н О) растворяют в 150 мл

2 н. соляной кислоты и смешивают с

1 г малахитового зеленого в 100 мл

2 н. соляной кислоты; через 1-2 ч фильтруют через бумажный фильтр, 55 хранят в темной склянке).

Через 5-10 мин отмечают пятна зеленого цвета на оранжевом фоне.

В описанной хроматографнческой системе аналогично фоксиму проявляется и имеет такое же значение величины Rf байтекс, близкие значения

Rf — дифос, трихлорметафос-З,трихлорметафос. Для исключения их проводят . дополнительную реакцию обнаружения с 4- аминоантипирином. На хроматографическую пластинку наносят аликвоту элюата, эквивалентную 2 г органа, а также пятно метчиков - байтекса и других фосфорорганических пестицидов (ФОП ) (3-5 мкг в пятно ) и хроматографируют в той же системе.

Пластинку опрыскивают 6%-ным раствором гидроксида натрия, нагревают при 120 С в сушильном шкафу 30 мин.

По охлаждении опрыскивают 1Х-ным раствором 4-аминоантипирнна гидрохлорида, затем 1,4%-ным раствором феррицианида калия. В присутствии байтекса, дифоса, трихлорметафоса -3 и трихлорметафоса образуются пятна розового цвета.

Нри использовании пластинок "Силуфол" на стартовую линию наносят аликвоты элюата, эквивалентные

0,5 r органа, метчик — раствор фоксн ма в бензоле (1-2 мкг в пятно ).

Фронт растворителя 10 см. Обнаружение фоксима проводят палладиевым (или бромфеноловым синим ) и 4-НБП реактивами, обнаружение байтекса, дифоса, трихлорметафоса-3 и трихлорметафоса — реакцией с 4-аминоанти- . пирином. Rf-фоксима 0,40-0,63.

1(, Для подтверждения обнаружения фоксима и для дифференциации фоксима от байтекса, а также от других ФОП (при их обнаружении )проводят исследование на пластинках "Силуфол", импрегнированных 60%-ным раствором

ДИФА в метаноле, используя в качестве подвижной фазы н-гексан, насыщенный ДИФА. В связи с тем, что в данной хроматографической системе при исследовании может наблюдаться разброс в значениях Rf. особенно в присутствии следов экстрактивных веществ, используют внутренний стандарт (метчик ) - фоксим. Оценку результатов анализ по величинам Rf производят на основании сравнения Rf-исследуемой пробы, в которую введен внутренний метчик - фоксим, и исследуемой пробы, к которой внутренний метчик не был добавлен.

7 1 1 96

На пластинки "Силуфол" на расстоянии не менее 2,5 см от края и 2,5 см одна от другой наносят в виде пятен диаметром не более 0,5 см аликвоты исследуемых извлечений, эквивалентные 0 5 г органа. Приведенные аликвоты элюата являются оптимальными для граничных и приграничных концентраций фоксима - 230-400 мкг в 25 г органа, при больших концентрациях 10 наносят меньшие аликвоты раствора.

При этом из элюата каждого органа исследуют две аликвоты, к одной из иих добавляют внутренний стандарт фоксим (в количестве 5-10 мкг в ис; 15 следуемую аликвоту), к другой не добавляют. Фоксим-метчик добавляют в виде раствора в н-гексане или ацетоне непосредственно к отобранной аликвоте элюата, перемешивают, 20 органический растворитель удаляют до 0,2-0,5 мл и остаток наносят в виде пятна на пластинку ("Силуфол"

20х20 ). При обнаружении байтекса или других ФОП их также вводят в анализируемую пробу в качестве внутренних метчиков (5-10 мкг препарата в пятно ). Расстояние наносимых пятен от края хроматографической пластинки должно быть не менее 3 см, 30 расстояние между пятнами - не менее

2 си.

После нанесения на пластинку исследуемых проб и по удалении растворителя (5-)0 мин) пластинку погружают в бОЖ-ный раствор ДИФА в мета" ноле так, чтобы ее поверхность была смочена до уровня на 0,5 см выше нанесенных на стартовую линию исследуемых растворов ° Влажную часть 40 пластинки осушивают, прикладывая лист фильтровальной бумаги. Областьпластинки с пятнами и ниже стартовой линии опрыскивают из пульвери- . затора до легкого увлажнения раствЬ- 45 ром ДИФА в метаноле. Пластинку оставляют на 10-12 мин под тягой, затем помещают в хроматографическую камеру, содержащую н-гексан, насыщенный ДМФА. Предварительное насы- g0 щение камеры парами растворителя осуществляют в течение 1-1 5 ч.

Перед внесением каждой новой хро772 8 матографической пластинки камеру насыщают парами растворителя не менее 40 „мин. Фронт растворителя

12-14 см. Органический растворитель удаляют под тягой в течение

1, 5-2 ч. После этого пластинку иссс дуют реакциями, описанными в пунктах а и в, Rf фоксима

0,58-0,73. Определяют и сравнивают величины Rf проявленных зон пятен исследуемых извлечений (без внесенных метчиков-стандартов и с внесенными внутренними метчиками ), При одновременном присутствии фокси ма и других исследованных ФОП наблю дается четкое отделение их от фоксина. Экстрактивные вещества (Rf О:

0,90-1,0 ) также отделяются от фоксима..

Пример. Исследуют три пробы почек из трупа лица, погибшего от травматического повреждения. К полученным элюатам после хроматографической очистки, эквивалентеым 12,5 r навески, обозначенным Ф1 и 11 2, добавляют в виде раствора в ацетоне (100 мкг фоксима, в пробу 11 2 кроме того 200 мкг байтекса; проба ВЗконтрольная (фоксим и байтекс не добавляли ).

На пластинку "Силуфол" наносят в виде пятен на стартовую линию аликвоты полученных растворов (В1-3), эквивалентные 0,5 г органа. Параллельно к другим таким же аликвотам элюата проб В1-3 добавляют внутренний метчик — фоксим (5 мкг в пятно ).

Исследуют на пластинках "Силуфол"„ импрегнированных 60%-ным раствором

ДИФА в метаноле, в системе н-гексан, насыщенный ДИФА. Зоны разделенных веществ опытов представлены в таблице

Из таблицы следует, что в пробе

У1 обнаружен только фоксим (Rf

0,72-0,74), а в пробе 92 фоксим (Rf 0,71-0,73 и байтекс (Rf 0,470,50 }. Зоны с Rf О обусловлены . экстрактивными веществами, д Rf фоксима и байтекса составляет

0,23-0,24, что свидетельствует об . удовлетворительном разделении этих соединений в присутствии экстрактив ных веществ тканей почек.

1196772

1 Не добавляли О; 0,72

О; 0,74

О; 0,74

0; 0,72

I 5

2 Не добавляли О; О ° 47; 0,71 О; 0,50; 0,73

01 Оэ47 ° Оэ71 Ов Оэ501 Оэ73

2 5

3 Не добавляли

О

09 0,73

01 0 71

3 5

Заказ 7559/43 Тираж 896 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель М. Позняк

Редактор А. Шишкина ТехредЛ,Мартяшова Корректор В. Бутяга