Способ диагностики воспалительных заболеваний дыхательного тракта в фазе ремиссии

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УБЛИК (51) 4 А 61 39 00 G 01 N 33 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ /(,.;:

Н АBTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ЧМ, (21) 3627689/28-14 (22) 27.07.83 (46) 07.05.86. Бюл. ¹ 17 (71) Калининский государственный медицинский институт (72) И. С. Петрухин, И. Д. Понякина, К. A. Лебедев и В. С. Волков (53) 615.375 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1090409, кл. А 61 К 39/00, 1983. (54) (57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ДЪ|ХАТЕЛЬНОГО ТРАКТА В ФАЗЕ РЕМИССИИ путем определения количества спонтанных

„„SU„„1228863 А 1 е-розеткообразующих лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови, отличаюи(ийся тем, что, с целью повышения точности способа, перед определением кол ичества е-розеткообразующих лимфоцитов и нейтрофилов лимфоциты и нейтрофилы подвергают нагрузке при нагревании до 36 — 37 С в течение 0,5 — 1,5 ч и при уменьшении количества е-розеткообразующих лимфоцитов на 5—

30% и одновременном увеличении количества е-розеткообразующих нейтрофилов на 5—

30% по сравнению с первоначальным уровнем диагностируют воспалительное заболевание дыхательного тракта в фазе ремиссии.

1228863

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано для диагностики воспалительных заболеваний дыхательного тракта.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет нагревания клеток крови до 36--37 С

Способ осуществляют следующим образом.

К геперинизированной периферической крови (содержащей 20 — -60 ед гепарина в 1 мл) добавляют ЗЯ-ный раствор желатины в физрастворе в количестве 1 мл на

3 мл крови. Кровь выдерживают при 37—

38 С в течение 40 мин. Верхний лейкоцитарный слой собирают. Клетки дважды отмывают средой 199, осаждают каждый раз центри футированием при 200 g в течение 10 мин.

В промежутке между отмывками оставшиеся эритроциты лизируют путем добавления

1 мл дистиллированной воды на 15 с. Готовят супензию, содержащую 1 — -5 10" клеток в 1 мл. С полученной суспензией клеток ставят реакцию с-розеткообразования (c-PO) в двух вариантах.

Спонтанное ь-PO. К 0,1 мл суспензии клеток приливают 0,1 мл О,бо-ной суспензии эритроцитов барана. Смесь центрифугиру!От при 200 g в течение 5 мин и инкубируют при 4 С в течение 30 мин. Осадок осторожно ресуспендируют, фиксируют путем выдерживания с 0,05 мл ЗЯ-ного раствора глутарового альдегида в течение 5 мин и отмывают дистиллированной водой, осаждая центрифугированием при 200 g в течение

5 мин. Из осадка делают мазок, который сушат на воздухе. Мазок фиксируют путем выдерживания в метаноле в течение 10 мин и окрашивают метило; !м зеленым — - пиронином. Просчитывают 1;оличество с-розеткообразующих лимфоцитов на 100 лимфоцитов и с-розеткообразующих нейтрофилов на

100 нейтрофилов.

В-РО после предварительной нагрузки на клетки. В пробирку вносят 0,1 мл суспензии клеток, содержащей 1 — 5 10 клеток в 1 мл. Выдерживают при 36 — 37" С в течение

0,5 — 1,5 ч. После этого приливают 0,1 мл

О,бо-ной суспензии эритроцитов барана.

Ставят реакцию с,-ÐO и оценивают результаты так же, как и в случае спонтанного в- PO.

Для лимфоцитов и для нейтрофилоB Определяют разность между уровнями спонтанного ь-PO клеток и e-PO клеток после предварительной инкубации при 37 С, т. е. уровней В-РО лимфоцитов, полученных по первому и второму вариантам и уровней с-РО нейтрофилов, полученных по первому и второму вариантам. Если количество c-PO лимфоцитов уменьшается на 5--ЗОО и при этом количество В-РО нейтрофилов увеличивается на 5 — 30Я, то диагностируют ремиссию хронического бронхита.

5 !

О !

Нижний предел колебаний розсткообра3$I0(L(Hx T-лимфоцитов H HOЙтро(ри loB (5, „ j дан с тем расчетом, что нижняя цифра должна превы!Иатb ошибку одного измерения, составляющую не более 5Д- а верхний исходя из изменений дан!!010 параметра у больных хроническим бро)!хи.!Ом.

Пример 1. Рабочая H. E., 42 10:)а, обследОВана амбу,1атОрнО В и(р ио,l,д исп а нс> p H—

Зации. Для иммvно;!огическoго 00(л .",Ования у больной взяли 4 мл крови из локтевой вены в пробирку, содержащую 0,5 мл раствора ге«арина 1в концентрации 200 ед, мл l. KpoBI, перемешивали с 1,3 мл ЗЯ-ного раствора желBTины и ВыдLp жива. и д. !я расcла ива)11!я при 37 С в течение 40 мин. Верхний лейкоцитарный слой отбирали. Б пробирку, содержащую лейк(цитарный слои, приливали среду 199 до обьема 10 мл, перемешива)H.

Клетки осаждали центрифугированием )ри

400 С в течение 10 мин. Надосадочнук) жидкость сливали, осадок ресуснендирова!Ли.

Для лизиса оставшихся эритроцHTOB к осадку добавляли 1 мл дистиллированной воды. выдерживали 15 с. затем доливали среду

199 до обгьсма 10 мл. Клетки осажда.л и центрифугированием. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали. К осадку приливали среду 199 В !.аком количестве, чтобы концентрация клеток ь сус:1(нзии составила 1 — -5.10" в 1 мл.

С полученной суспензией с гав>! IH р Biiцию В-PO в двух зариантах.

К 0,1 мл пол,ченн)H суси(нзии клеток приливали 0,1 мл 0,6Я-Н0Н сус!!ензии эритроцитов барана, цснтрифугировали НрН

200 С 5 мин, инкубировали при 4 (30 мин, осадок ресуспендировали, добавляли 0,05 мл глутарового альi)åãèäà (ЗЯ-ного раствора), с которым выдерживали в тс ieHие 5 v»«», приливают дистиллированную Воду до объема 10 мл, центрифугировали при 200>g 5 мин, делали мазок. Мазок фиксипова.>!>. В метаноле, окрашивал и метилoBLiм зелены 4 — — пиронином и затем просчитывали к(>личество розеткообразующих клеток.

По второму варианту 0,1;:,1 >)олученной суспензии клеток инкубирова.IH при 37" С в течение 05 ч. После этого к сус«ензии приливали 0,1 мл !),6Я-ной с;пензии эритроцитов барана и ставили рсакц>:к) е-РО аналогично первому Варианту.

Данные подсчета уровней розеткообра!

УIОЩИХ КЛЕТОК ПОЗВО;IИЛИ ВЬ!ЯВИТЬ С.>ЕД) Ющее. Уровень спонтаннь!х В-РО,)И1!фоцитов составил 81 Я, е-РО нейтрофилов — — 19 .

3ти lloKB33TEa1H HHx0 )rJTcH B пР(::Ic.! ах НОРмы, поэтому на основании них 1Т. е. На основании

Определения только уровня cil >нтанн ых с-p03B1oKj к hBI(oM) -либо о!1;)е;:,(:ленно .il, Выводу прийти трудно. У этои жс ()Ог!ьной после предварите,)ьной;>агрузки Hr к)1 тки в Виде инкубации при 37 С и тече:!ие 0,5 ч уровень c-PO лимфоцитoB с(ста Вил 5? !g., В-РО нейтрофилов — 32(!(-,. Следовательно, 228863

Составитель Г. Когокова

Редактор О. Бугир Техред И. Берег Корректор Л. Обруча р

Заказ 2209!4 Тираж 660 Г1одписное

BHHHHH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий!! 3035, Москва, )К--35, Раув!ская наб.. д. 4i5

Филиал ПГ1П < Патент», г. Ух<город, ул. Проектная, 4 в результате нагрузки на клетки количестго в-PO лимфоцитов у данной больной снизилось на 29Я, а количество «-РО нейтрофилов повысилось на 13Я, что соответствуе1 диагнозу воспалительных заболеваний дыхательного тракта в фазе ремиссии. Клиническое

5 обследование подтвердило диагноз — хронический бронхит в фазе ремиссии. Больной было рекомендовано, а затем осуществлс !о профилактическое лечение с примене!!нем ингаляций раствором левамизола. 1О

Повторное обследование той же больной было осуществлено спустя 6 мес после курса профилактического лечения. В результате этого обследования было выявлено, что х ровень спонтанных в-PO лимфоцитов составил

65Я, в-PO нейтрофилов — 25Я, т. е. также в пределах нормы. В результате нагрузки в виде инкубации клеток в течение 0,5 ч при

37 С уровень «-РО лимфоцитов составил

68Я, уровень е-РО нейтрофилов — — ЗОЯ, т. е. по сравнению со спонтанным коли;сство

20 в-PO лимфоцитов увеличилось на 3 „, количество в-PO нейтрофилов увеличилось на

5,г, что соответствует состоянию нормы. о

В течение 6 месяцев после курса профилактического лечения у больной не наблюдалось ни одного обострения хронического бронхита, 25 клиническое обследование также подтвердило существенное улучшение состояния больной.

Пример 2. Больной В. С., 45 лет, обследован амбулаторно в период диспансеризации.

Им мунологическое обследование больного 30 осуществляли аналогично примеру 1. Исключение составило лишь время инкубации клеток при 37 С перед постановкой реакции

PO (второй вариант постановки реакции е-PO): клетки инкубировали при 37"-С в течение 1,5 ч.

Данные иммунологического обследования следующие: уровень спонтанных «-РО лимфоцитов составил 72 /, в-РО нейтрофилов — ЗЗЯ, что находится в пределах нормы.

После предварительной нагрузки в виде инкубации клеток при 37 С в течение 1,5 ч уровни E-PO лимфоцитов составили 59ф, в-PО нейтрофилов --- 49Я, т. е. уровни е-РО лимфоцитов понизились на 13ог„, уровни в-PO нейтрофилов повысились íà 16ß (в результате инкубации клеток в течение 0,5 ч 45 у того же больного уровни в-РО лимфоцитов по сравнению со спонтанными снизились на 15о, уровни в-РО нейтрофилов повысились на 18о ) . Это соответствовало диагнозу, поставленному больному в резхльтяте подробного клиническогn обследования: хронический бронхит в фазе ремиссии. Больному было рекомендовано, а затем осуществлено проф!пактичсское лечение путем ингаляций масляным раствором стафилококковой вакI!II I i ь!.

11овтор нос им м унол огическое обсл едовяние больного этим же способом спустя

6 мес. показало, что уровень спонтанных е-РО лнмфоцитов составил 75Я, е-PO нейтроф илов — 28Я. В результате нагрузки в вн;1С инкубации клегок в течение 1,5 ч при

37" С уровень c -РО лимфоцнтов (е-РОД) составил 60%, е-PO нейтрофилов (е-РОН)—

35% т. е. уровни е-РО7 повысились íà 15Ро уровни е-POH повысились на 7Я. что соответствует статусу хронического бронхита в ремиссии. Подробное клиническое обсле.1ование подтвердило постаьленный диагноз.

Зя период, прошедший с момента первого обследования, у больного дважды отмечалось обострение хронического бронхита.

1!ре lëàãàåìhiII спосо . позволяет выявить

;inc товерные разл !гния разностей уровней е-1эО лимф011итов н I:-РО неитрофилОв после инкубации клеток нри 36---37 С (в течение

0,5 пи 1,5 ч) и спонтанных v-РО, причем эти ре1зг1ичия являются не только достоверными. Но и существенными, Вместе с тем ряз. 111чия в ве, 1 нчи не разности (спонтсl нные е-РО клетки е-РО клетки) после применения:11!грхзки у здоровых и больных хроническим бронхитом в фазе ремиссии наиболее четко проявились в результате инкубацин клеток при 36 †-37"С. Прн более низкой температуре инкубацнн (35 C) различия в уровННх 3àHHû.; параметров проявились более слабо. В результате инкубации прн 38 С ухудшалось качество препаратов, поскольку клетки деформировались, что затрудняло

oLjnH1có результатов. Следовательно, оптимальной темпера гурой для инкубации клеток является 36 -37"С. Применение этой температуры позво,!яет выявить максимальные р я 3, ; I. ÷ и я В у 14 О в н я х и я 11 я х! еT p o B В Г р у и и я х при хорошем качестве препаратов.

Таким образом предлагаемый способ позволяет повысить то,ность диагностики в ! 00",,; случаев, поскольку согласно известномх способу осуществлять диагностику было невозможно.