Способ получения аденозинтрифосфатазы

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИ1ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sg 4 С 12 N 9/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАН ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3658486/28-14 (22) 31.10.83 (46) 23.05.86. Бюл. М - 19 (71) Всесоюзный ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт

"Микроб" (72) А. К. Адамов, Н. Г. Тихонов и Н. В. Майоров (53) 615.45:663.53(088.8) (56) Способ получения АТФ-азы из митохондрий сердца быка. — Биохимия, 1972, т. 37, 11 2, с. 348-353. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗЫ с помощью высаливания сульфатом аммония, центрифугирования и гель-фильтрации, о т л и ч а—

„„SU„„1232679 А 1 ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, аденозинтрифосфатазу выделяют из холерного вибриона классического биовара, серовара Инаба, штамм 569 В с инактивированиеи

0,1Х-ныи иертиолатом, центрифугированием культуры при 4000-6000 g в течение 25-30 мин, высаливанием сульфатом амиония при 90Х насыщения, отделением осадка через 16-18 ч центрифугированием при 4000-ЬООО g в течение 15"20 мин, гель-фракцией растворенного в дистиллированной воде осадка на акрилексе P-60 и гель-хроматографией на биогеле А-!50 М с последующей элюцией теис -буфером рН ?,5-8,0.

123? 679

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии.

Цель изобретения — упрощение способа эа счет использования клеточного аутолиза. 5

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения аденоэинтрифосфатазы (АТФ-азы) используют холерный вибрион классического биовара, серовара

Инаба, штамм 569 В.

Выращивают холерные вибрионы в реакторе-ферментере, затем инактивируют культуру 0,1%-ным мертиолатом.

В присутствии мертиолата происходит аутолиз (разрушение клеток вибрионов), в результате чего АТФ-аза выходит иэ клеточных мембран в культуральную жидкость, которая в дальнейшем служит источником фермента. 20

После аутолиза реакторную культуру центрифугируют для отделения ферментов разрушенных клеток при 4000-6000 g в течение 25-30 мин и иэ надосадка.

Через 16-18 ч сформировавшийся при высаливании осадок отделяют центрифугированием при 4000-6000 g в течение 15-20 мин, растворяют дистиллированной водой и обессоливают на колонке с акрилексом Р-60, элюируя ферментсодержащий белок 0,005 М т ис -НС1 буфером рН 7,6-7,8.

Обессоленный препарат, содержащий АТФ-аэу, гель-хроматографируют на колонке с биогелем А-150 M. Злю- 35 цию проводят 0,005 М грие -HC1. буфером рН 7,5-8,0.

Все операции по выделению и очистке фермента проводят под контролем определения удельной активности. 40

Степень очистки АТФ-азы составляет

4l,83 крат. Выход препарата фермента

1,5-2Х.

Пример. Культуру vibrio choferae 569 В выращивают в течение 8l0 ч в 250 л реакторе-ферментере в условиях аэрации при 34-36 С глубинным методом на бульоне из ферментированного гидролизата казеина рН 8,0, содержащего, Ж: пептон 2; NaC1 0,5; 50

Na P0Ä 0,05; аминного азота 200 мг.7..

Культивирование вибрионов продол-. жают до концентрации 55-65 млрд. микробных клеток в 1 мл, переносят реакторную культуру в бутыль емко- S5 стью 5 л и добавляют мертиолат (5 r сухого мертиолата растворяют в 20мл дистиллированной воды) таким образом, чтобы его конечная концентрация составляла 0,1Х.

Через 16-18 ч реакторную культуру с внесенным мертиолатсм высевают на питательные среды для контроля специфической стерильности. Результат высева учитывают в соответствии с режимом работы с особо опасными инфекциями через 8 сут. За это время при аутолиэе АТФ-аза переходит из мембран вибрионов в культуральную жидкость, из которой в дальнейшем получают фермент.

После учета контроля, подтверждающего стерильность реакторной культуры, ее центрифугируют для отделения разрушенных аутолиэом клеток при

4000-6000 g в течение 25-30 мин, Осадок, содержащий разрушенные клетки,, отбрасывают, надосадок, содержащий АТФ-азу, переносят в 10-л емкость и добавляют к нему сульфат аммония до 90Е насыщения, растворяют перемешиванием и оставляют для формирования осадка при комнатной температуре на 16-18 ч.

Через 16-18 ч насыщенную сульфатом аммония культуральную жидкость центрифугируют для получения осадка белка при 4000-6000 g в течение 1520 мин. Надосадок отбрасывают, а осадок, содержащий АТФ-аэу, в объеме

0,25-0,3 л растворяют дистиллирован-. ной водой из расчета: 1 ч. осадка +

1 ч. воды. Растворенный осадок 0,50,6 л фильтруют через бумажный фильтр и обессоливают на колонке с акрилексом P-60. Для этого колонку размерами 45х500 мм наполняют гелем акрилекса Р-60 в объеме 1 л1 уравновешенным

0,005 M т ис -HCF буфером рН 7,5-8,0.

На гель наносят 0,5-0,6 л растворенного дистиллированной водой осадка и элюируют со скоростью 350-400 мл/ч.

Сбор элюата проводят под контролем оптической плотности при 380 нм с помощью проточной спектрофотометричесхой кюветы.

Полученный препарат изучают на содержание белка, полисахаридов, нуклеиновых кислот.

На заключительном этапе получения

АТФ-азы применяют гель-хроматографию на колонке с биогелем A-150 М.

Для этого колонку размерами 15х300 мм наполняют бногелем А-150 в объеме

45 мл. уравновешенным 0,005 M тгис

HC f . буфером рН 7,5-8,0, и наслаивают

12326

Насадок культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибрионов 3

l3 2+!,2

Обессоленный ферменсодержащий препарат после элюции на колонке с биогелем

Р-60

746+76,3 4,82

412+35,0

5,55+0,15 после хроматографии на колонке с биогелем А-150 М 4

41,83

0,308+0,08 283+154,3 6472+1311 на него 25-30 мл обессоленного ферментного раствора. Элюцию проводят со скоростью 40-50 мл/ч. Фракции по

3-4 мл собирают на автоматическом коллекторе. Каждую фракцию изучают на содержание белка (по поглощению длины волны при 280 нм и более объективно по методу Лоури) и на активность АТФ-азы. Об активности АТФ-азы судят по нарастанию концентрации не- т0 органического фосфора Р в инкубационной смеси, содержащей, М: NaCE 10, КС Г 2 . 10 MnC Г 5 10; АТФ-динатриевой соли (Reana l) 3 10; таис -НС Г буфера 5 10 рН 7 6. 15

Наряду с опытной пробой одновременно ставят две контрольные, одна из которых содержит все компоненты инкубационной смеси, но вместо раствора белка в нее вносят равный объем 20 воды, другая содержит исследуемый белок, но вместо инкубационной смеси вносят воду

Концентрацию неорганического фосфора определяют фотометрически по 25 известному методу. Расчет увеличения содержания неорганического фосфора проводят вычитанием из концентрации

Р опытной пробы суммы концентраций

Р; двух контрольных проб. За едини- )p цу активности АТФ-азы принимают количество белка-фермента, которое спо79 4 собно за I ч инкубации прн 37 С высвободить из АТФ I мкг неорганического фосфора, Путем отношения АТФ-азной активности к !/10 концентрации белка (так как в опытную пробу вносят

0,1 мл) рассчитывают удельную активность фермента. Результаты определения удельной активности АТФ-аэы холерного вибриона на различных стадиях получения представлены в табл . 1.

Из табл . ) видно, что по сравнению с исходным материалом (надосадком культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибрионов) при обессоливании на колонке с акрилексом Р-60 достигается

4,82-кратная очистка, при гельхроматографии на колонке с биогелем

А-150 М вЂ” 41,83-кратная степень чис- тоты препарата.

Химический состав нативного и очищенного препаратов АТФ-азы представлен в табл. 2.

Иэ представленных в табл. 2 данных видно, что по сравнению с нативным препаратом конечный продукт фермент АТФ-аза, содержит в 3,9 раза меньше нуклеиновых кислот и в

62,8 раза меньше полисахаридов в расчете на 1 мг белка. Выход фермента составляет 1,5-2Х.

16 ),6+6,5 -154,7+) 2,7

1232679

Т а б л и ц а 2

Содержание белИсследуемый материал ка, мг/мл

1 мг белка 1 мл 1 мг белка

38,5+2,4

13,2+1,2 рионов (и 6) (1007.) (и 3) 0,308+0,08 0,23+0,009 0,74

0,14+0,009 0,45 (n8) (25,47) (n4) (и 5) (1,59X) П р и м е ч а н и е. Содержание нуклеиновых кислот и полисахаридов в надосадке культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибрионов принимают за 100Х.

Редактор Н. Гунько

Заказ 2737/27 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета. СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, Надосадок культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибОчишенный препарат фермента

АТФ-азы холерного вибриона

Показатели нуклеиновых Показатели поликислот, мкг нуклеи- сахаридов, мкг на . нового фосфора на .

371,7+35,7 28,2 (п=б) (1007) Составитель N. Позняк

Техред И.Попович Корректор М. Максимишинец