Способ получения иммобилизованной аминоацилазы

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19> 1111

/ жеро,о„

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, -" ., 7

/8 "

К llATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3411449/28-13 (86) РСТ/HU81/00008 (02.03.81) (22) 16 ° 03.82 (31) 1782/80 (32) 17.07.80 (33) HU (46) 30.04.86. Бюл. Р 16 (71) Реанал Финомведьсердьяр (HU) (72) Ласло Борош, Иван Дароци, Ирен

Хубер, Йожефне Ивони, Яношне Кишш и Бела Саяни (HU) (53) 577.15(088.8) (56) G. Amer. СЪен. Soc. 1959, 81, 4024.

Мас го|по1e cu le s 1 971, 4, 350 . (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АМИНОАЦИЛАЗЫ путем связывания ее с активированным носителем, представляющим собой синтетический полимер на основе акриламида, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения специфической активности ферментов, в качестве носителя используют гидролизованный на 507 сополимер акриламида и N,N †метилен-бис-акриламида, активированный водорастворимым карбодиимидом, процесс ведут при рН 6,5-8,0.

1 1228788 а

Изобретение относится к способам получения иммобилизованных ферментов, конкретно к способу получения иммобилизованной аминоацилазы, применяеMoA p c eHH DI, — àìèHîêèñëîò. установлено, что на основе фермента аминоацилазы может быть получен иммобилизованный ферментный препарат с высокой активностью в результате присоединения фермента к носителю, полученному частичным гидролизом сополимера акриламида и N N -метилен-бис-акриламида типа "Akrilex P", Целью изобретения является повышение специфической активности ферментов.

Сущность способа заключается в том, что если этот сополимер подвергнуть гидролизу кислотой (например, соляной кислотой или другой сильной кислотой) или щелочью (например, гидроокисью натрия), углекислым натрием или другим сильным основанием, то приблизительно 50Х.-СО-NH, -групп превращается в карбоксильные группы, в то время как остальная часть-СО-NH

-групп в жестких условиях проведения реакции не распадается. Таким обра-. зом, в гидролизованном сополимере между карбоксильными группами вклиниваются неизменные-СО-NH. — ãðóïïû, которые поддерживают карбоксильные группы в благоприятном пространственном положении.

Когда фермент аминоацилазы присоединяют к образовавшимся карбоксильным группам в результате известного активирования карбодимидом, фиксированные молекулы фермента вследствие благоприятного пространственного расположения карбоксильных групп не препятствуют друг другу выполнять свою функцию. В результате этого препарат фермента отличается очень высокой специфичной активностью.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Частично гидролизованный сополимер, образовавшийся в результате кислотного или щелочного гидролиза сополимера акриламида и

N N -метилен-бис-акриламида типа

У

"Akrilех P" обрабатывают растворимым в воде или растворимым при температуре ниже 0 С в органическом растворителе ,о, карбодиимидным соединением и на активированный указанным способом носитель наносят аминоцилазу в растворе со значением рН 6,5 — 8,0.Полученный продукт промывают, после чего в нужном случае сушат.

При осуществлении способа в качестве фермента может быть применена вы5 депенная любым известным способом аминоацйлаза любого происхождения, однако наиболее предпочтительно применят:ь в качестве исходного вещества фермент, выделенный из почек млеко— питающих.

Для активирования частично гидролизованного сополимера типа "Akri1ех Р" в качестве карбодиимидного соединения могут быть применены, 15 например, t-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-мето-и-толуолсульфонат или 1-этил-3-(3 -диметиламинопропил)-карбодиимиц. В качестве карбодиимидного.соединения наиболее

20 предпочтительно применять растворимые в воде вещества. Среди карбодиимидных соединений, растворимых тольв органических растворителях, при осуществлении способа могут быть применены лишь такие производные, которые в применяемом растворителе имеют соответствующую растворимость при низкой температуре (т.е. ниже 0 С) .

На активированный носитель амино30 ацилазу наносят из раствора со значением рН 6,5 — 8,0, причем наиболее предпочтительно, когда рН,этого раствора составляет около 7,0. Наиболее целесообразно растворять аминоацилазу в 0,1 М буферном растворе фосфата калия (рН 7,0) .

Образовавшийся в результате реакции связывания препарат фиксированного фермента промывают известным способом, после чего в нужном случае сушат. Однако содержащий фермент препарат может быть приготовлен в присутствии соответствующих стабилизаторов, например азида натрия в виде суспенg5 зии .

Специфичная. активность полученного по изобретению препарата, содержащего фиксированный фермент, составляет 150-200 ед.мг ксерогеля, что в сравнении с активностью 0,55

2,24 ед.мг ксерогеля, достигаемой при осуществлении известного способа, означает повышение актинйости по крайней мере на два порядка.

55 При исследовании препаратов нового типа, "îäåðæàùèõ иммобилизованный фермент, пришли к выводу, что в результате иммобилизации возрастает

1228788 сухого вещества стабильность фермента при значениях рН, лежащих в основной области, что особенно благоприятно в случаях, когда препаратиммобилизованного фермен а применяют для расщепления Р?,— аминокислот.

Пример 1. 30 г ксерогеля

"Akrilex P=100" суспендируют в 1 л

1 н. водного раствора гидроокиси натрия. Суспензию выдерживают 3 ч о при 50 С. Набухший гель промывают до нейтральной реакции 12 л дистиллированной воды, после чего промывку продолжают 10,5 л 0,05 н. соляной кислотой, Наконец, гель промывают

30 л дистиллированной воды. Промытый гель подвергают лиофилизации.

Получают 26 г носителя фермента, связывающаяся емкость которого состав— ляет 6, 14 M-ЭКВ. г.

Пример 2. 10 г ксерогеля, полученного в соответствии с примером 1, суспендируют в 500 мл буферного раствора фосфата калия (pH 7,0).

Затем к приготовленной суспензии на водяной бане, охлаждаемой льдом, прибавляют при энергичном перемешиВании полученный с 250 мл холодного (+4 С) буферного раствора раствор 20 г

1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)- .

-карбодиимид-мето-п-толуолсульфоната. После 10 мин перемешивания к реакционной смеси прибавляют полученный с 250 мл холодного (+4 С) буферного раствора раствор 5 r аминоацилазы. Суспензию перемешивают 48 ч о при + 4 С, затем гель отделяют и промывают 3 раза 1 л 0,1 M буферного раствора фосфата калия (рН 7,0), 3 раза 1 л 0,1 M буферного раствора фосфата калия (рН 7,С), содержащего

0,5 моль хлористого натрия, и, наконец, 3 раза 1 л 0,1 М буферного раствора фосфата калия (pH 7,0). Затем гель 4 раза промывают 2,5 л дистиллированной воды с целью удаления соли и проводят лиофилизацию.

Выход: 18 г фиксированной аминоацилазы. Активность: гидролиз

158 мкмоль N-ацетил-L-метионина (ч/мг) Пример 3. 10 г ксерогеля, полученного в соответствии с примером 1, суспендируют в 500 мл 0,1 мл

0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0). Затем на охлаждаемой льдом водяной бане и при энергич5

55 ном перемешивании к сусие прибавляют полученный с 250 мл холодного (+4 С) буферного раствора раствор

10 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)—

-карбодиимида. После 10 мин перемешивания к реакционной смеси прибавляют о, полученньнЗ с 250 мл холодного (+4 С) буферного раствора раствор 5 г аминоацилазы. Суспензию перемешивают 48 ч при +4 С, гель отделяют и промывают н

3 раза 1 л О, 1 М буферного раствора фосфата калия, 3 раза 3 л 0,1 М буферного раствора фосфата калия, содержащего 0,3 моль хлористого натрия, 3 раза 1 л О,! М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0) и, наконец, 4 раза 2,5 л дистиллированной воды.

Отмытый от солей гель подвергают лиофилизации.

Выход: 16 г фиксированной аминоацилазы. Активность: гидролиз

202 мкмоль N àöåòHë-L-метионина (ч/мг) сухого вещества.

Пример 4. 0,5 r ксерогеля, полученного в соответствии с примером 1,.суспендируют в 25 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (pH

6,0) и затем добавляют к полученной суспензии при охлаждении на ледяной водяной бане и постоянном перемешивао нии холодный (+4 С) раствор r 1—

-цикл о гексил- 3- (2-морфолиноэ тил ) — ка р— бодиимид-мето-п-толуолсульфоната в

12,5 мл буферного раствора. После

10 мин перемешивания к реакционной смеси добавляют раствор 0,25 г аминоО ацилазы в 12,5 мл холодного (+4 С) буферного раствора. Суспензию перео мешивают 48 ч при +4 С, гель отделяют и промывают его последовательно трижды 50 M буферного раствора фосфата калия (рН 6,0), трижды 50 мл

0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 6,0), содержащеro 0,5 М хлористого натрия, трижды 50 M буферного раствора фосфата калия (рН 6,0) и четырежды 125 мл дистиллированной воды. Отмытый от соли гель лоифилизируют.

Выход: 0,68 г иммобилизированной аминоацилазы. Активность: гидролиз

21,4 мкмоль N-ацетил-L-метионина (ч/мг) сухого вещества.

Пример 5. 0,5 r ксерогеля, полученного в соответствии с примером 1, суспендируют в ?5 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 8,0) и добавляют к суспензии при охлаждении на ледяной водяной бане, Составитель О. Скородумова

Техред И.Верес Корректор С. Черни

Редактор М. Кечемеш

Заказ 2302/62

Тираж 490

ВНИИНИ Государстенного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1228788 Ь при постоянном перемешивании раствор фата калия (рН 8,0), 3 раза 50 мл

1 r 1-циклогексил-3-(2-морфолино- 0,1 М буферного раствора фосфата зтил)-карбодиимид-мето -п-толуол-суль- калия (рН 8,0), содержащего 0,5 М фоната в .12,5 мл холодного (+4 С) хлористого натрия, 3 раза 50 мл 0,1 М буферного раствора. После 10 мин пе- буферного раствора фосфата калия .ремешивания к реакционной смеси до- (рН 8,0) и 4 раза 125 мл дистиллиробавляют раствор 0,25 г амиíoàöèëàзы ванной воды. Отмытый от.соли гель в 12,5 мл холодного (+4 С) буферного лиофилизируют. о раствора. Суспензию перемешивают Выход: 0,18 r иммобилизированной

48 ч при +4 С, гель отделяют и про- tî аминоацилазы. Активность: гидролиз о мывают его последовательно 3 раза 52,9 мкмоль N-ацетил-Ь-метионина

50 мл 0,1 М буферного раствора фос- (ч/мг) сухого вещества.