Способ определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода gersinia

 

Использование: в медицинской микробиологии. Сущность изобретения: получают бесклеточный экстракт бактерий рода Yersinia (15·10¹⁰ - 21·10¹⁰ клеток на 1м дистилированной воды), смешивают его в соотношении 1:9 с реакционной смесью, приготовленной на 0,4 М трис-hcl буфере с pH 7,2 и содержащей 0,012 моль/л глюкозо - 6 - фосфата; 0,009 моль/л окисленного НАДФ и 0,02 моль/л Mgcl₂, инкубируют при 36-37^oС в течение 110-120 мин, отбирают 10-20 мкл инкубационной смеси, наносят на бумагу марки Ватман N 1, подсушивают при комнатной температуре и визуально по флуоресценции в ЦФ-свете устанавливают присутствие образующегося в реакции восстановленного НАДФ. 2 табл.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia.

Известен способ определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia, основанный на том, что под действием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в присутствии глюкозо-6-фосфата образуется НАДФН₂, который учитывают количественно по оптической плотности [1] Однако этот способ не позволяет определять активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia визуально по флуоресценции, что является его недостатком.

Наиболее близким к изобретению является способ определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia путем приготовления бесклеточного экстракта бактерий, инкубации бесклеточного экстракта в реакционной смеси, содержащей глюкозо-6-фосфат, НАДФ, MgCl₂ и трис-НСl буфер с последующим определением продукта реакции НАДФН₂ по оптической плотности в ультрафиолетовом свете (УФ-свете) при длине волны (S) 340 нм. Отсутствие изменения оптической плотности свидетельствует об отсутствии продукта реакции, а значит и фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы или его активности у исследуемого штамма бактерий рода Yersinia [2] Однако известный способ не позволяет определять активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia визуально по флуоресценции, что является его недостатком.

Целью изобретения является расширение возможностей способа и определение активности фермента визуально по флуоресценции.

Это достигается путем приготовления бесклеточного экстракта бактерий, инкубации бесклеточного экстракта в реакционной смеси, содержащей глюкозо-6-фосфат, НАДФ, MgCl₂ и трис-НСl буфер с последующим определением продукта реакции НАДФН₂ в УФ-свете, причем отличие от известного способа заключается в том, что количество бактерий в бесклеточном экстракте составляет 15 ˙ 10¹⁰ 21 ˙ 10¹⁰ в 1 мл, реакционную смесь используют при следующем соотношении компонентов, г/л: (моль/л) глюкозо-6- фосфат 3,66-3,68 0,01203-0,01209 НАДФ 0,771-0,777 0,00089-0,00090 MgCl₂ 1,90-1,92, 0,0200-0,0202 трис-НСl буфер рН 7,2 До 1 л Инкубацию бесклеточного экстракта бактерий в реакционной смеси проводят при 36-37^оС в течение 110-120 мин, затем 10-20 микролитров инкубационной смеси наносят на бумагу Ватман N 1, пятно подсушивают при комнатной температуре и рассматривают в УФ-свете.

Эти отличия позволяют определять продукт реакции НАДФН₂, а значит и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы визуально по флуоресценции, а не количественно по оптической плотности за счет изменения количества бактерий в бесклеточном экстракте, массовой концентрации компонентов реакционной смеси, температуры и времени инкубации бесклеточного экстракта в реакционной смеси, а также за счет нанесения определенного объема инкубационной смеси на бумагу Ватман N 1, подсушивания пятна при комнатной температуре и рассматривания в УФ-свете.

В табл. 1 дано обоснование необходимого количества бактерий в бесклеточном экстракте, массовой концентрации глюкозо-6-фосфата, НАДФ и MgCl ₂ в реакционной смеси, температуры и времени инкубации бесклеточного экстракта в реакционной смеси и объема инкубационной смеси, наносимой на бумагу, для надежного определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia.

Из табл. 1 следует, что для всех изученных штаммов вида Y.pseudotuberculosis и вида Y. pestis надежно выявляется визуально флуоресценция. Причем между штаммами этих двух видов бактерий визуально видна разница в ее интенсивности. Флуоресценция надежно выявляется визуально за счет увеличения количества бактерий в бесклеточном экстракте в 3-4,2 раза, массовой концентрации глюкозо-6-фосфата и НАДФ в реакционной смеси в 3 и 3,2 раза, температуры инкубации до 36-37^оС и времени инкубации бесклеточного экстракта в реакционной смеси в 14-15 раз, а также за счет нанесения инкубационной смеси в объеме 10-20 микролитров на бумагу Ватман N 1, подсушивания пятна при комнатной температуре и рассматривания в УФ-свете.

В табл. 2 представлены сравнительные данные определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia известным и предлагаемым способом.

Из табл. 2 следует, что изменение оптической плотности надежно определяется у бактерий рода Yersinia во всех случаях, как предлагаемым способом, так и известным способом. В то же время, флуоресценция надежно выявляется только предлагаемым способом.

Таким образом, отличительные признаки, включенные в формулу изобретения, обеспечивают при наличии глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в присутствии глюкозо-6-фосфата образование большего количества НАДФН₂, которое надежно выявляют визуально в виде флуоресценции. Использование этого способа для бактерий рода Yersinia впервые позволило по флуоресценции определить активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы визуально. Поэтому можно сделать вывод о соответствии изобретения критерию "изобретательский уровень".

Способ осуществляется следующим образом.

Бактерии выращивают на агаре Хоттингера рН 7,2 при 37^оС в течение 72 ч. Затем 15 ˙ 10¹⁰ 21 ˙ 10¹⁰ бактерий растирают со стеклянным порошком при 4^оС. Добавляют 1 мл дистиллированной воды рН 6,7 и настаивают растертые бактерии в течение 20 мин при той же температуре. Заранее готовят реакционную смесь. Для этого берут 4,84 г триса и в него заливают 250 мл дистиллированной воды. Эту смесь перемешивают до полного растворения. Затем к смеси добавляют 45 мл 0,1 М раствора соляной кислоты (НСl). Эту смесь тоже перемешивают и переливают в мерную колбу объемом 1 л. Затем объем смеси доводят дистиллированной водой до 1 л, смесь перемешивают, при этом образуется 0,04 М трис-НСl буфер рН 7,2, который является основой для получения реакционной смеси. Далее отвешивают другие компоненты, г: глюкозо-6-фосфат 3,66-3,68 НАДФ 0,771-0,777 MgCl₂ 1,90-1,92
Каждую из этих навесок переносят поочередно в 50 мл приготовленного ранее 0,04 М трис-НСl буфера рН 7,2, перемешивают до полного растворения и сливают в другую мерную колбу объемом 1 л. Затем объем смеси доводят приготовленным трис-НСl буфером до 1 л, смесь еще раз перемешивают, при этом образуется реакционная смесь, которую используют для определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia.

Наливают в пробирку 2,7 мл реакционной смеси, добавляют к ней 0,3 мл бесклеточного экстракта бактерий и смесь перемешивают. Пробирку помещают в ультратермостат. По секундомеру замечают время. Инкубацию бесклеточного экстракта бактерий в реакционной смеси проводят при 36-37^оС в течение 110-120 мин. Затем 10-20 микролитров инкубационной смеси наносят на бумагу Ватман N 1, пятно подсушивают при комнатной температуре и рассматривают в УФ-свете при S 340 нм. Выявляют визуально флуоресценцию.

Способ демонстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Бактерии штамма Y.pseudotuberculosis серовар I выращивали на агаре Хоттингера рН 7,2 при 37^оС в течение 72 ч. Затем 15 ˙ 10¹⁰ бактерий растирали со стеклянным порошком при 4^оС, Добавляли 1 мл дистиллированной воды рН 6,7 и настаивали растертые бактерии в течение 20 мин при той же температуре.

Заранее готовили реакционную смесь. Для этого брали 4,84 г триса и в него заливали 250 мл дистиллированной воды. Эту смесь перемешивали до полного растворения. Затем к смеси добавляли 45 мл 0,1 М раствора солянок кислоты (НСl). Эту смесь тоже перемешивали и переливали в мерную колбу объемом 1 л. Затем объем смеси доводили дистиллированной водой до 1 л, смесь опять перемешивали, при этом образовывался 0,04 М трис-НСl буфер рН 7,2, который являлся основой для получения реакционной смеси. Далее отвешивали другие компоненты, г: глюкозо-6-фосфат 3,66 НАДФ 0,771 MgCl₂ 1,90
Каждую из этих навесок переносили поочередно в 50 мл приготовленного ранее 0,04 М трис-НСl буфера рН 7,2, перемешивали до полного растворения и сливали в другую мерную колбу объемом 1 л. Затем объем смеси доводили приготовленным трис-НСl буфером до 1 л, смесь еще раз перемешивали, при этом образовывалась реакционная смесь, которую использовали для определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia.

Наливали в пробирку 2,7 мл реакционной смеси, добавляли к ней 0,3 мл бесклеточного экстракта бактерий и смесь перемешивали. Пробирку помещали в ультратермостат. По секундомеру замечали время. Инкубацию бесклеточного экстракта бактерий в реакционной смеси проводили при 36^оС в течение 110 мин. Затем 10 микролитров инкубационной смеси наносили на бумагу Ватман N 1, пятно подсушивали при комнатной температуре и рассматривали в УФ-свете при S 340 нм. Выявляли визуально интенсивную флуоресценцию.

П р и м е р 2. Бактерии штамма Y.pseudotuberculosis серовар III выращивали на агаре Хоттингера рН 7,2 при 37^оС в течение 72 ч. Затем 18 ˙ 10¹⁰ бактерий растирали со стеклянным порошком при температуре 4^оС. Добавляли 1 мл дистиллированной воды рН 6,7 и настаивали растертые бактерии в течение 20 мин при той же температуре.

Заранее готовили реакционную смесь. Для этого брали 4,84 г триса и в него заливали 250 мл дистиллированной воды. Эту смесь перемешивали до полного растворения. Затем к смеси добавляли 45 мл 0,1 М раствора соляной кислоты (НСl). Эту смесь тоже перемешивали и переливали в мерную колбу объемом 1 л. Затем объем смеси доводили дистиллированной водой до 1 л, смесь опять перемешивали, при этом образовывался 0,04 М трис-НСl буфер рН 7,2, который являлся основой для получения реакционной смеси. Далее отвешивали другие компоненты, г: глюкозо-6-фосфат 3,67 НАДФ 0,774 MgCl₂ 1,91
Каждую из этих навесок переносили поочередно в 50 мл приготовленного ранее 0,04 М трис-НСl буфера рН 7,2, перемешивали до полного растворения и сливали в другую мерную колбу объемом 1 л. Затем объем смеси доводили приготовленным трис-НСl буфером до 1 л, смесь еще раз перемешивали, при этом образовывалась реакционная смесь, которую использовали для определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia.

Наливали в пробирку 2,7 мл реакционной смеси, добавляли к ней 0,3 мл бесклеточного экстракта бактерий и смесь перемешивали. Пробирку помещали в ультратермостат. По секундомеру замечали время. Инкубацию бесклеточного экстракта бактерий в реакционной смеси проводили при 36,5^оС в течение 115 мин. Затем 15 микролитров инкубационной смеси наносили на бумагу Ватман N 1, пятно подсушивали при комнатной температуре и рассматривали в УФ-свете при S 340 нм. Выявляли визуально интенсивную флуоресценцию.

П р и м е р 3. Бактерии штамма Y.pestis ЕВ выращивали на агаре Хоттингера рН 7,2 при 37^оС в течение 72 ч. Затем 21 ˙ 10¹⁰ бактерий растирали со стеклянным порошком при 4^оС. Добавляли 1 мл дистиллированной воды рН 6,7 и настаивали растертые бактерии в течение 20 мин при той же температуре.

Заранее готовили реакционную смесь. Для этого брали 4,84 г триса и в него заливали 250 мл дистиллированной воды. Эту смесь перемешивали до полного растворения. Затем к смеси добавляли 45 мл 0,1 М раствора соляной кислоты (НСl). Эту смесь тоже перемешивали и переливали в мерную колбу объемом 1 л. Затем объем смеси доводили дистиллированной водой до 1 л, смесь перемешивали, при этом образовывался 0,04 М трис-НСl буфер рН 7,2, который являлся основой для получения реакционной смеси. Далее отвешивали другие компоненты, г: глюкозо-6-фосфат 3,68 НАДФ 0,777 MgCl₂ 1,92
Каждую из этих навесок переносили поочередно в 50 мл приготовленного ранее 0,04 М трис-НСl буфера рН 7,2, перемешивали до полного растворения и сливали в другую мерную колбу объемом 1 л. Затем объем смеси доводили приготовленным трис-НСl буфером до 1 л, смесь еще раз перемешивали, при этом образовывалась реакционная смесь, которую использовали для определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий рода Yersinia.

Наливали в пробирку 2,7 мл реакционной смеси, добавляли к ней 0,3 мл бесклеточного экстракта бактерий и перемешивали. Пробирку помещали в ультратермостат. По секундомеру замечали время. Инкубацию бесклеточного экстракта бактерий в реакционной смеси проводили при 37^оС в течение 120 мин. Затем 20 микролитров инкубационной смеси наносили на бумагу Ватман N 1, пятно подсушивали при комнатной температуре и рассматривали в УФ-свете при S 340 нм. Выявляли визуально слабую флуоресценцию.

Использование предлагаемого способа позволяет визуально по флуоресценции определять активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у бактерий, причем появилась возможность осуществлять дифференциацию бактерий рода Yersinia одновременно по интенсивности флуоресценции.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ У БАКТЕРИЙ РОДА GERSINIA, включающий приготовление бесклеточного экстракта бактерий, смешивание его в соотношении 1 9 с реакционной средой, содержащей глюкозо-6-фосфат, окисленный НАДФ, MgCl₂ и трис-HCl-буфер, инкубацию полученной смеси и последующее определение образующегося в реакции восстановленного НАДФ в УФ-свете, отличающийся тем, что бесклеточный экстракт получают из расчета (15 21) · 10¹⁰ клеток на 1 мл, используют приготовленную на трис-HCl-буфере с рН 7,2 реакционную среду со следующими концентрациями компонентов, моль/л:
Глюкозо-6-фосфат 0,01203 0,01209
Окисленный НАДФ 0,00089 0,00090
MgCl₂ 0,0200 0,0202
инкубацию проводят при 36 37^oС в течение 110 120 мин, после чего 10 20 мкл инкубационной смеси наносят на бумагу ватман N 1 и подсушивают при комнатной температуре, а присутствие восстановленного НАДФ определяют визуально по флуоресценции в УФ-свете.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2