Способ подготовки лигноцеллюлозосодержащего материала для определения в нем белка

 

(В) SU (11) 1267900 А1 (51) 5 GQI ÈÇÇ 50

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСП1ЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЩОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

K АВТОРСКОМУ СВИЛЕ ПИЬСТВУ

{21) 3842?58/13 (22) 3401.85 (46) 30.31.È Бюл. Na 43-44 (73) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР (72) Шульга АВ„Брустовецкая Т.П. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 8 НЕМ БЕЛКА (57) 1267900,15

Изобретение относится к области микf20580110/ биотехнологии, биохимии и -;3" сеется определения белка в растительном материале и культурах микроорганизмов, выращенных на средах с лигноцеллюлоз- ным субстратом.

Значительную трудность представляет определение белка в таких сложных биоб!огических субстратах, !<8K лигноцелглолозосодержащие материалы (опбилки, солома, гузапая, торф и т,д.) и микробная 6иомасса. выращенная! На таких материалах, и содер жащая неутиб!Изираванные целлюлоау, ллгнин и продуктьб их разложения, В таких Случаях Особенно важна предварительная подготовка биологического f;:,0териала.

1.1ельа изобретения яаляетсеб повышение степени очистки пробы и тем самым повышение точности Определения 6 ней белка.

При Обработке лигноцеллболозного маториала предлагаемым способом обеспечи8881 GA ОТДеление 68213<8 GT неРас1е!ОРббмг2го лигноцеллюлозного субстрата, материала клеточных стенок и других кислогонерастБоримых полисяхаридов за счет использовании11 акстракции белков конц<3нтрироаанным раствором трихлоруксусб!Ой кислоты (ТХУ), При зкет128кции белков коббцб.!бтрированным p30780pQM ТХУ Однавремегп40 в раб теор г4ереходят нуклеино!31,18 кисл оть4

Йрбдукты иу, гидролиза и другие низкомолО кулярные азотистые вещества. Последу!Оецее разбавление смеси дистиллироваГ!1!ой еодОЙ в 3 6 раза (до КЙЕбцен циееиби ТХУ в растворе ОЯ-1,2 М) приводит к осаждению белка 6 Вещества сОДВр>кащие и<Рбелкбвый азот 4НУклеиновые кислоты и продукты их гидролиза), Оста!Отся в растворе. Таким абРЭЗОМ, ОС&ДОК. КОТ012ьб<1 ИСПользУЕтСЯ Для дальнейшего определения белка, содер>кит

ЛИаь НЕЗНаЧИтЕЛЬНОЕ КОЛИ 4ЕСТВО 111!ГНИ!!а и других сог1утствуащих г1римесей, что позвоЛяоттоциб ОПрЕдЕЛИТЬ Солар>КаНИЕ В Пг>обак гбигГ!Оцеллlолозосодер>кащего мат64>иала истиllнйго белка метОдами, 4используеблыГ11! для массового анализа, а именно 110 количеству общего азота и с помощ! !О кумасси 4.325О.

Был проведен 120 ис!< Оптимаебьн ых 42я раметров Обработки лиг!!Оцелл40110зосодержащего материала для сохранения точности метода определения белка, экстрагируемого из этого материала, 88 истинное с42де12>ке3ние белка в пробе лигноцеллюлозосодер><ащег0 материала при4411блалось 4<42личество белка, определенное пс сумме аминокислОт при аГ.!ино <исб!отном анализе

412

g% P

40 с Обработкой материала гбо способу-прототипу, Определение содер>кания белка биомассы гриба РЬОИО<а е1212егсе31оза 151, выращон .0ro на 012ur.êах, в зависимости от кон4481прации ТХУ для зкстракции белка и е1реме14И зкстракции показало, что область

Оп гимальных гба(2аГлетров для экстОакции белка HBxop, JfTCß 0 plif !0!38 5 м t Ху и 3 MilH зкстракции. Г1ри уменьшении взятых интер891f0D были Определены границы атой области от 4,5 до БЯ М ТХУ и время экстракции от 2,5 до 3,5 мин (табл. 1).

) ля гбоиска Оптимальных параметров разведения ХУ вЂ” экстракта для осаждения белка была исследована область 0Т 0,5 М до

1,". » !24! 4с иббтерВалом 0,1 б б1 4, Из гбредставле1!!!ых в табл.2 данных 013ределяли оптимальну19 область !2аз13едения

IX" -зкете2актч(ОТ09 Л ц012 М)

Способ погбсняется следующими примерами, В0 всех примерах. Приведены также результаты определе!!ия белка в аналогичных

4f j2048> с использованием в качестве контр0

1я известньбх спосОб(ав Обработки г!рОбы и измере! lия количества балка. Во всех табли" цах приведены С12ед44ие значе!4ил из трех параллельГ!ых Опредеб2ений, П р и м е p "., 1 ç"=веску измельченной пшеничной.с42г!ОМЕ,! иб!и ОГ1илок 100 MI зели вагот 2 мл 5 М раствора трихлоруксусной кислоты и.етыдерже1вабот !!а кипящей водяН04ч Ьапв В ТЕ 48!1ИЕ . :4È .;, !!20бу ЦЕГ!ТрИфуГиру!От 10 миг< при 5000с! и c)12ернатаГ1т

P38D8033éf0T ХОЛОДНОЙ @11CTéffii p088HHoé

ВОдсбтб „ 0 КОНЕ НВ!й КОНцЕНтрацИИ трИХЛОруксусной кислоты 1 М, Охлажда1от в течение 16 ми!1 в ледяной бане и це3п рифугиру!От при 1000og 10 мин. Содержание белка Ог.редел.f:0T с помощью реактива кумасси и по содержани!о общего аз отг4

4-езугбьте3ТЕ:! и родс валены в табл, 3, П р л м е ;2 2. Наг4еску биомассы гриба

РЙ20440Еа fèb8fcofosà 151. выращенного на березовы < Огбилках, обре2батывабот спОсо бом,.описанным в примере 1, но выдерживают пробу в 4,5 M три:<лоруксусной кислоте в течение 2,5 мин на Ki пящей водяной бане, а супсрнатант г,осле 1-го цантрифугирован и я () а 3 б2 с2 ев Е4 10 т Д и с т и л л и О О в а н и О Й водой до КОне 4Г10Й концент(2ации ТХУ 0,9 М, Результаты 032иведены в табл, 4, ! р и и в р 3, Навеску биомассы грлба дСY81T40пl fflli .2p 6":.02Е1, вblpащеHHог0 Hа пбве44И н Ой соломе, обрабатыва!От спасо20м, оп44са4444ы! в 423241 .28328 1, Но np05j выдер»<ива!от в 5, М ТХ . в те !ение 3,5 мин. а

1267900

Таблица 1

Содержание белка биомассы гриба Phollota tuberculous

151, выращенного на опилках, в зависимости от концентрации ТХУ для зкстракции белка и времени зкстракции (содержание белка в данной биомассе при определении по сумме аминокислот 3,01%) Табл и ца 2

Содержание белка биомассы гриба Phollota tubeгсо(ова 151, выращенного на опилках, в зависимости от ра: оавления

ТХУ -зкстракта дистиллированной вод, й

15 Таблица 3

Содержание белка в лигноцеллалозосодержащем материале при определении предлагаемым и известным способами (содержание белка по сумме аминокислот: в соломе 0,95, в опилках — 0,49 >) L

1Извес работк супернатант после 1-ro центрифугирования разбавлиот дистиллированной водой до конечной концентрации ТХУ 1,2 М, Результаты приведены в табл, 5. 5

Таким образом, предлагаемый способ предварительной обработки лигноцеллюлозосодержащего материала для определения в нем белка позволяет повысить 10

Иэмер белка

L щем а точность наиболее быстрых широко применяемых в серийных и единичных анализах методов, т.е. довести ее до уровня, получаемого при использовании наиболее точного из всех известных методов количественного определения белка. (56) Термхитарова Н, Г„Шульга А. 8, Прикладная биохимия и микробиология.

1974, т, 10, Я 6, с. 928. I,2 б7900

П ; сдоб!яен 1е табл.З.!!ЕЛОК, g

1- .ОЛ 0 ! 1) !.(Беоеаовые оиил- (И вЂ” — — -- -)

Г1,25 (! "7) ! Е 1! ) 1 1:! (i !, Ê

0,40

0, 6

< (j ." j

t! !.::.л . с .:" . ! »1! О,!Г!.- делениц !1!1едпсъгаеf .-1 1 " (. i! с." .1! .1с с1Г 11 41! (сОД81> .а11ые !

P) Q0! (.. !!!1. 1;! .:.1Ол, .1ца 5 " с.;;: !.! «| : ! ! ! (!Л: i! !

1 0

СЧ1!. ..!1а 0!,I1t,t!Ñf!.,! IÈß беt к::, !

1Е 1!Е IOLtthtO I;!r „Iäã(.,rt

;.; 1 Р Е Г „rl а Д Е 1, 1.: Ц (Д Е 1 P t.1

Ь е,"! О „

1 ! ! (t

1

,00 !

J ! !

1267900

Составитель

Редактор Н.Тимонина Техред М.Моргентал Корректор Л.Филь

Заказ 3333

Тираж Подписное

HflO "Поиск" Роспатента

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ЛИГНОЦЕЛЛК)ЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО . МАТЕРИАЛА

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 8 HEM БЕЛКА, предусматривающий отбор пробы и нагрева. ние ее в . растворе трихлоруксусной кислоты на кипящей водяной бане с после: дующим центрифугированием и выделением супернатанта, отличаащийся тем, что, с целью повышения степени очистки пробы и тем самым повышения точности определения в ней белка, концентрацию раствора трихлоруксусной кислоты выбирают в пределах 4,5 - 5,5 M. нагревание ведут в течение 2,5 - 3,5 мин и выделенный при центрифугировании супврнатант разбавляют дистиллированной водой до конечной концентрации трихлоруксусной кислоты . 0,9 - 1,2 M c последующим повторным цен.10 трифугированием для выделения белоксодержащего осадка.