Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах

Авторы патента:

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - повьшение точности и чувствительности способа. К венозной крови добавляют этилендиаминтетрацетат (ЭДТА), осандают эритроциты. Промывают осадок. К эритроцитарной массе добавляют раствор сапонина и затем фосфатный буфер. В раствор с ЭДТА, фосфатным буфером и глутатионом добавляют разведенный гемолизат. Через 3-5 мин добавляют еще гидроперекись трет-бутила. После инкубации осаждают белок на ледяной бане. Пробу центрифугируют. Супернатант переносят в насыщенный раствор хлористого натрия и добавляют нитропруссид натрия и двууглекислый натрий. После этого измеряют оптическую плотность при 540 им и рассчитывают активность глутатионпероксидазы. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) Ш4С01N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАм изОБРетений и ОткРытий (21) 3779924/28-14 (22) 14.08.84 (46) 07.01.87. Бюл. ¹ 1 (7 1) Белорусский научно-исследовательский институт неврологии, нейрохирургии и физиотерапии (72) А.P.Ãàâðèëoâà и Н.Ф.Хмара(53) 612. 015 (088. 8) (56) Journal of biol chem., 1975, ч. 250,№ 13, р. 5144-5149. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ В ЭРИТРОЦИТАХ (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения вЂ” повышение точности и чувствительности способа.

К венозной крови добавляют этилендиаминтетрацетат (ЭДТА), осащцают эритроциты. Промывают осадок. К эритроцитарной массе добавляют раствор сапонина и затем фосфатный буфер. В раствор с ЭДТА, фосфатным буфером и глутатионом добавляют разведенный гемолизат.. Через 3-5 мин добавляют еще гидроперекись трет-бутила. После инкубации осаждают белок на ледяной бане, Пробу центрифугируют. Супернатант переносят в насыщенный раствор хлористого натрия и добавля" ют нитропруссид натрия и двууглекислый натрий. После этого измеряют оптическую плотность при 540 нм и рассчитывают активность глутатионпероксидазы.

3 2

Е вЂ” оптическая плотность станст дартной пробы (не содержащей гемолизата и гидроперекиси трет-бутила);

Е вЂ” оптическая плотность нит Р ропруссида в пробе, не содержащей супернатанта.

Пример 1. Определение активности ГП проводят в пробе с конечным объемом 0,5 мл, содержащей 50 мМ фосфатный буфер с рН 7,4, 21 мМ GSH, 2 мМ ЭДТА и гемолизат с конечным разведением фермента в пробе в l00 раз (по отношению к эритроцитарной массе) ° о

Среду инкубируют 5 мин при 37 С и затем начинают реакцию добавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации в пробе 8 мМ. Окисление GSH останавливают через 10 мин при встряхивании в ледяной бане, осаждая белок 1мл

ЗЖ-ной НРО, приготовленной на насыщенном NaC1.

К серии опытных проб ставят контрольную и стандартную пробы. Гидроперекись трет вЂ бути в стандартной пробе, а гемолизат в стандартной и контрольной пробах замещают соответствующим объемом дистиллированной воды.

Пробы центрифугируют при 1

2 тыс.об./мин, после чего О, 1 мл супернатанта переносят в 3,9 мл насыщенного NaC1, добавляют 0,5 мя 80 мМ нитропруссида Na и 0,05 мл 1,8 М

Na СО . Экстинкцию измеряют спектрофото- или фотоколориметрически через

15 с после добавления Na CO> при .

540 нм. Фоновое поглощение нитропруссида Na определяют в пробе, не содержащей надосадка. Активность рассчитывают по формуле (1). Средняя активность ГП у 14 здоровых доноров 144,6

А22,4 ммоль/мин/л эритромассы.

1 128200

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в аналитической и клинической биохимии для определения активности глутатионпевЂ” роксидазы (ГП) .

Цель изобретения вЂ” повышение точности и чувствительности способа за счет использования оптимальных концентраций субстратов и остановки реакции осаждением белка при О + 1 С. 10

Способ осуществляется следующим образом.

К 0 5-5 мл венозной крови добавляют этилендиаминтетрацетат (ЭДТА, 1 мг/мл), осаждают эритроциты, про- 15 мывают осадок О, 15 М хлористым натрием, приготовленным на 0,005 М фосфатном буфере, рН 7,4, к эритроцитарной массе добавляют раствор сапонина О, 1 мг/мл в соотношении 1:2, а 20, через 30 мин вЂ” 0,05 M фосфатный бувЂ” фер, рН 7,4, в соотношении к гемоливЂ” зату 1:14, 1:4.

К О, 15 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,4 содержащего 0,002-0,03 М

ЭДТА и 0,025-0,035 М восстановленный глутатион (GSH), добавляют 0,05 мл разведенного гемолизата, выдерживают

3-5 мин при 37 С и начинают реакцию добавлением 0 05 мл 0,02-0,04 М гид- 3Р роперекиси трет-бутила. После инкубао дии при 37 С в течение 4-10 мин осаждают белок на ледяной бане добавлением 0,5 мл 37.-ной НРО» приготовленной на насьщенном растворе NaC1. Про-35 бу центрифугируют, 0,05-0,1 мл супернатанта переносят в 3, 9-3, 95 мл насыщенного NaC1, через 3-60 мин добавляют 0,5 мл 0,08 М нитропруссида натрия и 0,5 мл 1,8 М Na и через 15 с 4р измеряют оптическую плотность при

540 нм.

Активность ГП в 1 л эритроцитарной массы рассчитывают по формуле (С8Н1 Е„- Е.„

А = вЂ” ---, х вЂ” вЂ” вЂ” Х N

Ест Eq (GSH) вЂ” исходная концентрация

0 глутатиона;

t вЂ” время от начала до остановки реакции;

N вЂ” фактор разведения эритромассы;

Е„ вЂ” оптическая плотность контрольной пробы (не содержащей гемолизат);

Е вЂ” оптическая плотность an опытной пробы;

Пример 2. Определение актив. ности ГП проводят по примеру 1, однако среда инкубации содержит 14 мМ

GSH и гемолизат с конечным разведением в 150 раз. Реакцию начинают до-. бавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации 4 мМ, а останавливают через 5 мин. Осаждение и определение уровня остаточного глутатиона проводят по примеру 1. Активность рассчитывают по формуле (1). Активность ГП составляет

144,6 + 4 ммоль/мин/л.

Пример 3. Определение активности ГП проводят в пробе с ко нечным объемом 0,5 мл, содержащей

1282003 4 ность рассчитывают по формуле (1). Активность ГП составляет

144,6 + 4 ммоль/мин/л.

Формула изобретения

Составитель Н.Гуляева

Редактор И.Николайчук Техред Л.Сердюкова Корректор А.Ильин

Заказ 7258/41 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое. предприятие, r.Ужгород, ул.Проектная, 4

50 мМ фосфатный буфер с РН 7,4, 18 мМ GSH, 2 мМ ЭДТА и гемолизат с конечным разведением фермента в пробе в 120 раз. Среду инкубируют 5 мин при 37 С и затем начинают реакцию о добавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации 6 мМ в начальный момент реакции. Окисление GSH останавливают через 6 мин при встряхивании в ледяной бане, осаждая белок

1 мл 37.-ной НРО> приготовленной на насыщенном NaC1. Контрольную и стандартную пробы ставят по примеру 1.

Пробы центрифугируют при 1

2 тыс.об./мин, после чего О, 1 мл супернатанта переносят в 3,9 мл насыщенного NaC1 добавляют О ° 5 мл 80 мМ нитропруссида Na, а затем 0,5 мл

1,8 N Na СОз. Экстинкцию измеряют через 15 с спектрофото- или фотокалориметрически. Фоновое поглощение нитропруссида Na определяют в пробе,,не содержащей надосадка. АктивСпособ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах

10 путем их гемолиза, инкубации гемолизата в присутствии восстановленного глутатиона и гидроперекиси трет-бутила с последующим спектрофотометрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, используют глутатион в концентрации 1421мМ, гидроперекись трет-бутила в концентрации 4 - 8 мМ, реак20 цию останавливают осаждением белка при температуре 0 < 1 С, а к суперо натанту добавляют нитропруссид натрия в щелочной среде.

Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах

Изобретение относится к медицинской биохимии, может быть применено при получении биологически активного белкового продукта - лейкоцитарного бета -гликопротеида для получения моноспецифических антисывороток, определения этого белка, а также для тестирования его биологической активности

Способ диагностики кислородной интоксикации при гипербарической оксигенации // 1280545

Изобретение относится к медицине , касается диагностики кислородной интоксикации, может быть применено в клинике при лечении методом гипербарической оксигенации (ГБО) и при повьшенных контактах человека с увеличенным давлением кислорода

Способ определения содержания меди в сыворотке крови // 1276989

Изобретение относится к области биофизики, молекулярной биологии, медицины и может быть применено для элементного анализа крови

Способ определения глутаматоксалацетаттрансаминазы или глутаматпируваттрансаминазы // 1276269

Изобретение относится к клинической биохимии и предназначено для определения глутаматоксалацетаттрансаминазы и глутаматпируваттрансаминазы и реагента для их определения

Способ определения активности комплексных соединений гепарина в плазме крови // 1273804

Изобретение относится к медицине , может быть применено в биохимии крови для определения функционального состояния противосвертывающей системы организма

Способ выявления осложнений при кори // 1273803

Изобретение относится к медицине , касается прогнозирования вторичных осложнений при заболевании корью у детей раннего возраста для проведения своевременной иммунокоррекции, что облегчает течение болезни

Способ диагностики сальмонеллезной инфекции у детей // 1273802

Изобретение относится к медицине

Способ оценки эффективности лечения ишемической болезни сердца антиоксидантами // 1273801

Изобретение относится к кардиологии

Способ определения церулоплазмина в сыворотке крови // 1273800

Изобретение относится к биохимии , в частности к клиническим лабораторным исследованиям

Способ диагностики эндометриоза // 1273799

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, и может быть использовано для диагностики эндометриоза

Способ контроля состояния сельскохозяйственных и пищевых веществ или лекарственного препарата и устройство для его осуществления // 2100805

Способ определения в пробе цельной крови распределения вероятностей в популяции эритроцитов их подмножеств и устройство для его осуществления // 2100807

Способ определения гетероциклических нитросоединений в биологическом материале // 2100808

Способ выявления лимфоидных узелков в тотальных анатомических препаратах // 2101699

Изобретение относится к медицине, а именно к анатомии, топографической анатомии, патологической анатомии и может быть использовано для изучения лимфоидных узелков в тотальных анатомических препаратах макромикроскопическом поле видения в норме, в возрастном аспекте, в эксперименте и патологии

Способ ионного парамагнитного резонанса на нервном волокне // 2101700

Изобретение относится к медицине, в частности к способам неинвазивной диагностики функционирования биологических мембран и соответствующей оценке метаболических процессов в организме на клеточном уровне

Способ прогноза хронического рецидивирующего течения заболевания у лиц, перенесших первичную рожу // 2101701

Изобретение относится к медицине, а именно инфекционным болезням и дерматологии, и может найти применение как в стационарных, так и поликлинических условиях

Способ определения реактивного лизиса клеток // 2101702

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для определения реактивного лизиса клеток в содержащей комплемент биологической жидкости в клинической практике и в научных исследованиях

Способ определения наличия активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите // 2101703

Изобретение относится к медицине и предназначено для оценки активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите путем биохимического исследования сыворотки крови

Способ дифференциальной диагностики миокардита и миокардитического кардиосклероза // 2102749

Устройство для локального подведения биологически активных веществ // 2102750