Способ получения 19-эпидианемицина и штамм @ @ атсс 39205, используемый для получения 19-эпидианемицина

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотика. Цель изобретения - создание способа получения нового антибиотика 19-эпидианемицина и штамма, продуцирующего данный антибиотик . Штамм Streptomyces hygrosco- picus эыделен из образца почвы. Депонирован в American Туре Culture Collect ., номер АТСС 39205. Штамм культивируют в жидкой питательной среде, содержащей церилозу в качестве источника углерода, соевую муку в качестве источника азота и минеральные соли. Выделяют целевой продукт путем экстракции ферментационного бульона метилизобутилкетоном. 2 с.п. ф-лы, 1 3 . п. ф-1щ. СО с ьо со Oi О4

СО1ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИчЕСКИх

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY (21) 3706216/30-14 (22) 14.02.84 (31) 466.468 . (32) 15.02.83 (33) (46) 07.03.87. Бюл. В 9 (71) Пфайзер Инк. (US) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (72) Вальтер Даниэль Селмер, Вальтер

Патрик Каллен (VS), Хироси Маеда

{Jp) Джон Корниш Раддок (GB) и Юн-, сукероси Тоне (JP) (53) 615.779.93 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 19-ЭПИДИАНЕМИЦИНА И ШТАММ STRRPTOMYCES HYGROSCOPICUS АТСС 39205, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ 19-ЭПИДИАНЕИИЦИНА

„,SU „„1296010 А 3

СЮ 4 C 12 Р 1/06// (С 12 Р 1106,""

С 12 R 1:55 (57} Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотика. Цель изобретения — создание способа получения нового антибиотика 19-эпидианемицина и штамма, продуцирующего данный антибиотик. Штамм Streptomyces hygroscopicus выделен из образца почвы. Депонирован в American Type Culture Collect., номер АТСС 39205. Штамм культивируют в жидкой питательной среде, содержащей церилозу в качестве источника углерода, соевую муку в качестве источника азота и минеральные соли.

Выделяют целевой продукт путем экстракции ферментационного бульона метилизобутилкетоном. 2 с.п. ф-лы, 1 з.п. ф-лы.

129б010

Изобретение относится к микробиологической промышленнОсти и касается получения антибиотика.

Целью изобретения является создание способа получения нового антибиотика и штамма, продуцирующего данный антибиотик.

Штамм Streptomyces hygroscopicus выделен из образца почвы, взятого в

Вашингтоне, Д.С. Депонирован в American Type Culture Collection под номером АТСС 39205.

Культурально-морфологические признаки.

Агар на дрожжево-солодовом экстракте. Рост хороший, рыжевато-коричнеBblA c KeJxToBRTblMH краями мембран, умеренно приподнятый, складчатый до пленочного, воздушный мицелий отсутствует. Обратная сторона бледно-желтоватая с коричневыми линиями, растворимый пигмент коричневый.

Агар с овсяной мукой. Рост умеренный, белый, желтоватый до серого, почти серые серии. Тонкий до слегка приподнятого, гладкий, гигроскопичный в некоторых участках воздушный мицелий такой же, как поверхность; обратная сторона бесцветная, кремовая до серой, почти серые серии; растворимый пигмент бледно-желтоватый.

Агар с неорганическими слоями и крахмалом. Рост умеренный до хорошего, желтоватый до серого, почти серые серии; тонкий до приподнятого, гладкий, но по краям складчатый, гигроскопический на некоторых участках; воздушный мицелий такой же, как поверхность. Обратная сторона бледножелтоватая до серой, почти серые се-, рии; растворимый пигмент бледно-желтоватый.

Агар с глицерин -аспарагином. Рост плохой до умеренного, бесцветный до кремового (почти серые серии); тон- 45 кий, гладкий, воздушный мицелий от-. сутствует. Обратная сторона бесцветная растворимый пигмент отсутствует.

Агар с глюкозой-аспарагином, Рост хороший, белый до кремового, приподнятый, складчатый, воздушный мицелий белый, обратная сторона бледно-желтоватая, растворимый пигмент бледно-желтоватый.

Смесь агара Чапека и сахарозного агара. Рост умеренный до хорошего; кремовый, тонкий, гладкий с размытыми краями, нет воздушного мицелия; обратная сторона бесцветная до кремовой; растворимый пигмент кремовый.

Агар Эмерсона. Рост хороший, рыжевато-коричневый, приподнятый, гладкнй до слегка складчатого; воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона такая же, как поверхность. Растворимый пигмент коричневый.

Питательный агар — рост умеренный,. кремовый, слегка приподнятый, гладкий или наблюдающийся в виде отдельных колоний; воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона бледно-желтоватая„ Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Беннета. Рост хороший, кремовый, умеренно приподнятый, складчатый до ребристого, воздушного мицелия либо нет, либо он рассеянный, белый; обратная сторона кремовая до бледносеровато-желтой; растворимый пигмент бледно-желтоватый.

Тирозиновый агар Гордона и Смита.

Рост плохой до умеренного, желтоватокоричневый до темно-коричневого, тонкий до слегка приподнятого, гладкий, воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона темно-коричневая; растворимый пигмент коричневый до черного °

Агар с малатом кальция. Рост умеренный, кремовый, тонкий до слегка приподнятого, гладкий; воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует.

Казеиновый агар. Рост умеренный ,цо хорошего, кремовый, слегка приподнятый, гладкий до слегка морщинистого, воздушный мицелий отсутствует.

Обратная сторона кремовая; растворимый пигмент розовато-коричневый.

Желатиновый агар. Рост хороший, кремовый, умеренно приподнятый, гладкий, у краев складчатый; воздушныймицелий отсутствует; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент кремовый.

Агар с крахмалом. Рост хороший, кремовый, умеренно приподнятый, складчатый, у краев гладкий; воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент кремовый.

Агар с картофелем и морковью. Рост умеренный, кремовый, тонкий, гладкий; воздушный мицелий рассеянный„ белый; обратная сторона бесцветная до кремовой; растворимый пигмент отсутствует.

Агар на водопроводной воде. Рост плохой, бесцветный, до кремового, тонкий, гладкий, в основном погруженный, воздушный мицелий рассеянный, белый, обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует..

Морфологию изучают на агаре с неорганическими солями через 14 дней инкубирования: споровая масса в серии 10 серого цвета; споровые цепи в секции спиралей слегка открыты, небольшого диаметра (6-10 мкм длины и 3-4,5 мкм ширины) 3 — Ь витков на спираль, 8—

30 спор на споровую цепь; спорофоры 15 моносподиево разветвленны, иногда Мутовчато разветвленны; споры овальные до эллиптических, иногда формы палочек ладьеобразные., 1,2-2,0х0,9-1,2 мкм, с наростами по данным ска- 20 нирующей электронной микроскопии.

Физиолого-биохимические свойства.

Меланин не вырабатывает, сероводород образует, желатин ожижает, крахмал гидролизует, нитраты восстанав25 ливает до нитритов.

Целлюлозу не разлагает. Молоко просветляет без коагуляции.

Казеин переваривает, малат кальция переваривает, тироэин переваривает.

Усваивает глюкозу, арабинозу, фруктозу, инозитол, маннитол, раффинозу, рамнозу, сахарозу и ксилозу.

Хорошо растет при 21-28 С, умерен- 35 ный рост при 37 С, отсутствует рост при 45 С.

Стенки клеток содержат ZZ-диаминопимелиновую кислоту, но не содержат характеристических сахаров. 40

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, г/л:

Церилоза 20,0

Соевая мука 10,0

Растворимые в дистилли- 45 рованной воде вещества 5,0

Сульфат натрия 0 5

Хлорид кобальта 0,002

Карбонат кальция 2

В качестве растворимых в воде 50 веществ используют роетстимулирующие вещества: вытяжки из зерен, рыбную муку, муку хлопковых семян, дрожжевой экстракт.

100 мл среды помещают в 300-мил- 55 лилитровые встряхиваемые колбы и стерилизуют при 120 С и давлении 15 пси в течение 30 мин. После охлаждения среду инокулируют суспенэией вегета10 4 тивных клеток Streptomyces hygroscopicus ATCC 39205, выращенных на среде

АТСС 172-агар. Колбы встряхивают при

28 С на роторном шейкере со смещением

3,7-7,5 см и 150-200 циклов/мин в течение 3-4 дней. Одну колбу используют для инокуляции 5-литрового ферментера, заполненного 3 л питательной среды следующего состава, г/л: церилоза

20,0, соевая мука 10 0 растворимые в дистиллированной воде вещества 5 0 сульфат натрия 0,5, карбонат кальция

2,0, хлорид кобальта 0,002, рН

6,9-7,0 °

В качестве антивспенивающего агента добавляют 1 мл Z6 1 силикона, и ферментер герметизируют и стерилизируют при 120 С в течение 45 мин. Сосуды инокулируют из одной колбы (в расчете на 37 инокулюм), ферментируют в течение 96-168 ч при 30 С, перемешивают со скоростью 1700 об/мин, со скоростью подачи воздуха V воздуха на V жидкости в минуту.

После завершения ферментации культуральную жидкость фильтруют при натуральном рН с помощью диатомовой земли. Фильтровальную лепешку измельчают в метаноле, фильтруют, растворитель концентрируют в вакууме, разбавляют 2-3 объемами воды, затем дважды экстрагируют 1/3 до 1/2 объемами ра- створителя, например, метилизобутилкетона. Слои растворителя отделяют от водной фазы испарением или центрифугированием, а затем концентрируют в вакууме до вязкого масла.

Антибиотик можно выделять экстрагированием культуральной жидкости при нормальном рН метилизобутилкето- ном, удалением растворителя и концентрированием до вязкого масла. Мас- ло суспензируют в гептане и порцию обрабатывают силикагелем 60. Силикагельную лепешку элюируют хлороформом, смесью хлороформа: этилацетат и этилацетатом. После концентрирования этилацетатной фракции получают неочи- щенный продукт, из которого 19-эпидианемицин кристаллизуется в виде смеси натрий/калиевой соли.

В результате исследований с помощью тонкослойной хроматографии неочищенного продукта в системах, каждая из которых разделяет смесь дианемицина и 19-эпидианемицина, обнаружен только 19-эпидианемицин (таблица).

129601

Система

Дианемицин 19-эпидианемицин

Зтилацетат.

0,3

Хлороформ:ацетон 1:1

0,49 10

0,42

Этилацетат:

:хлороформ 2:1

0,15 0,22

f5

Аналогичные результаты получают при использовании следующих сред.

Среда М, содержащая, г/л,", целлюло.за 10,0, кукурузный крахмал 10,0, соевая мука 10,0, твердый продукт из 20 кукурузы-, усвояемый 5,0, хлорид натрия 5,0, карбонат кальция 1.,0, вода до 1 л. рН 6, 9-7,0.

Среда М, содержащая, г/л: церелоза 10,0, крахмал 20,0, дрожжевой 25 экстракт 5,0, хлорид кобалыа 0,002, NZ амин А 5,0, карбонат кальция 1,0, вода до 1 л, рН 6,9-7,0.

Пример 2. Инокулюм выращива— ют во встряхиваемых колбах, содержа- 30 щих 0,7 л среды с. Z 13 М, в течение

3-5 дней при 28 С и используют для инокулирования 6434,5-литрового ферментера, содержащего 4542 л среды

CZ13 N. На одну емкость используют приблизительно 1 л (0,05%) инокулюма.

Продукт ферментации после 4 дней собирают приблизительно в количестве

4164 л. Бульон экстрагируют i/5 объе-ма метилизобутилкетона при нейтраль- 10 ном рН, выделяют на экстракторе и растворитель упаривают в вакууме до масла. Получают 30,3 л концентрата.

Полученное масло концентрируют далее в циклонном испарителе до сиро- 15 па. После концентрирования полученное масло суспендируют в гептане, перемешивают с силикагелем, затем фильтруют через слой силикагеля и повторно промывают гептаном. Антибиотик элюируют последовательно хлороформом, смесью хлороформ-этилацетат, этилацетатом и

50%-ным ацетоиомв этилацетате. Активные фракции объединяют, концентрируют и повторно хроматографируют для выделения антибиотика. Пропускание активных элюатов вниз через гранулированный уголь Дарко дает возможность удалить посторонние примеси и повы0 6 сить выход. Попучают 40 r кристаллического 19-эпицианемицина.

Пример 3. Приблизительно

4164 л ферментационной среды Str.. hy.—

gxoscopicus ATCC 39205 получают по примеру 2. Весь бульон экстрагируют

1/5 объемом метилизобутилкетона и экстракт концентрируют в вакууме до коричневого масла (приблизительно

3,79 л). Концентрат выливают в 11,4 перемешиваемого гептана и полученную взвесь фильтруют через слой диатомовой земли.

Полученный фильтрат обрабатывают

3 кг силикагеля 60 в колонне (70230 мешей). Силикагель промывают порциями по 11,4 л гептана, хлороформа, ацетона и метанола. Эти фракции исследуют тонкослойной хроматографией и обнаруживают, что 19-эпидианемицин находится преимущественно во фракциях из ацетона и хлороформа.

Ацетоновую фракцию (180 г) хроматографируют на колонке 8х100 см, набитой силикагелем Мегск 60 (230400 мешей) в этилацетате. B качестве элюирующего растворителя используют этилацетат. Скорость потока составляет 70 мл/мин и отбирают фракции приблизительно по 1 л каждая. Эти фракции исследуют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля

Anaj.tech GF, проявленных в этилацетате. Эти пластины проявляют, опрыскивая ванилиновым реагентом (3 г ванилина в 75 мл этанола и 25 мл 85%-ной о фосфорной кислоты) и нагревая до 80 С.

В этих условиях 19-эпидианемицин появляется в виде пурпурного пятна.

Фракции, содержащие 19-эпидианемицин, объединяют и выпаривают. Полученный концентрат растворяют в 1 л хлороформа, промывают 1 л подкисленной воды (рН 4), затем 1 л буфера 5% двухосновного фосфата натрия (рН 9), сушат.над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают. Полученный концентрат помещают в ацетон и добавляют небольшое количество (приблизительно 10%) воды, после чего 19-эпидианемицин кристаллизуется в виде натриевой соли. Кристаллы собирают фильтрованием и сушат в вакууме при комнатной температуре. Выход составляет 23 r натриевой соли.

Хлороформовую фракцию после обработки силикагелем (280 r) повторно растворяют в 1 л хлороформа и пропускают через колонку 7х120 см, набитую

12960

10 8

Найдено, : C 64,45; H 8,84; 0

26,61.

Антибиотик обладает антикокцидозным и антибактериальным действием, а также повышает скорость роста,эффективность усвоения корма крупного рогатого скота.

Формула изобретения

Составитель Г.Смирнова

ТехредЛ.Сердюкова Корректор Л.Пилипенко

Редактор С.Патрушева

Заказ 631/64 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 гранулированным активированным углем в хлороформе. Ее элюируют хлороформом со скоростью 20 мл/мин и собирают фракции по 300 мл. Фракции, содержащие антибиотик, объединяют и концентрируют. Концентрат кристаллизуют в виде натриевой соли для ацетоновой фракции. Выход 14 г. Второй раз получают еще 10 r неочищенного материала.

Натриевая соль 19-эпидианемицина плавится при 193-205 С.

УФ „„, =232 нм, Е„=157; д-> =+11,0 (с=1, метанол) .

Вычислено, : С 63,49; Н 8,73;

0 (по разности) 27,78.

Найдено, 1: С 63,10; Н 8,86;

0 28,04.

Свободную кислоту получают, промывая хлороформовый раствор натриевой 20 соли подкисленной водой (рН 4), а затем выпаривая хлороформ. Кристаллизация этого соединения не происходит и оно получается в стеклообразном виде.

УФ „,„, =232 нм Е 163

,=+15,6" (с=1, метанол)

Вычислено, .: С 65, 10; H 9,06; 0 (по разности) 25,84.

С„Н,„0

1. Способ получения 19-эпидианемицина, заключающийся в том, что штамм Streptomyces hygroscopicus

АТСС 39205 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях и выделяют целевой продукт путем экстракции ферментационного бульона метилизобутилкетоном, 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве источника углерода используют церилозу, а в качестве источника азота — соевую муку.

3. Штамм Streptomyces hygroscopicus АТСС 39205 (American Туре Culture

Collection), используемый для получения 19-эпидианемицина.