Способ получения ферментированных спиртовых напитков

 

Изобретение относится к бродильной промьшшенности и может найти применение в пивоваренной, спиртовой и винодельческой промьшшенности. Целью изобретения является снижение содержания диацетила. Сусло, используемое для получения пива или этанола , или виноградный сок подвергают ферментации дрожжами с последующим его созреванием. В процессе ферментации или после нее, илив процессе созревания вводят фермент, превращающий ацетолактат. В качестве фермента используют ацетолактатдекарбоксилазу или изомеразу, или редуктоизомеразу. Фермент и дрожжи используют в иммо- .билизованном виде. Ацетолактатдекарбоксилазу используют в химически модифицированном виде для обеспечения стабильности и/или активности ее при значении рН среды 4-5. 3 з.п. ф-лы. i ОТ с со о со о со 02 ы

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flG ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3420528/28-13 (86) РСТ/DK 81/00076 (06. 08. 81) (22) 06.04.82 (31) 3398/80 (32) 07.08.80 (33) DK (46) 07.04.87. Бюл. Ф 13 (71) Де Форенеде Бриггерир А/С (DK) (72) Свен Эрик Годтфредсен, Иартин Оттесен и Бент Аренст

Ларсен (1Ж) (53) 663.44(088.8) (56} Патент США У 3130055, кл. 99-48, опублик. 1964. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРИЕНТИРОВАННЫХ СПИРТОВЫХ НАПИТКОВ (57) Изобретение относится к бродиль— ной промышленности и может найти

„„SU„, 1303033 Аз (51)4 С 12 С 11/04 С 12 G 1/02 применение в пивоваренной, спиртовой и винодельческой промышленности, Целью изобретения является снижение содержания диацетила. Сусло, используемое для получения пива ил и этанола, или виноградный сок подвергают ферментации дрожжами с последующим

его созреванием, В процессе ферментации или после нее, или. в процессе созревания вводят фермент, превращающий ацетолактат. В качестве фермента используют ацетолактатдекарбоксилазу или изомеразу, или редуктоизомеразу.

Фермент и дрожжи используют в иммобилизованном виде. Ацетолактатдекарбоксилазу используют в химически модифицированном виде для обеспечения стабильности и/или активности ее при значении рН среды 4-5. 3 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к бродильной промышленности и может найти применение в пивоваренной, спиртовой и винодельческой промышленности.

Цель изобретения — снижение содержания диацетила.

Способ осуществляют следующим образом.

Сусло, содержащее углеводы, подвергают ферментации дрожжами и созре- 1О ванию. Если сусло или виноградный сок ферментируют с помощью дрожжей или других микроорганизмов, помимо спиртовой ферментации происходят различные процессы, которые мо6"ут вызвать образование нежелательных побочных продуктов. Примером является об— разование диацетила, который обладает сильным и неприятным запахом даже в очень малых концентрациях, при 20 этом спиртовые напитки, например пиво или вино, могут приобрести неприемлемый вкус и аромат, если содержание диацетила превышает допустимую его концентрацию. 25

Образование диацетила невыгодно также в промышленнных процессах производства этанола, так как путем перегонки очень трудно отделить диацетил от этанола. Проблема возникает 30 при получении абсолютированного этанола, если этанол дегидрагируют азеотропной перегонкой с бензолом. Диацетил при этом накапливается в бензольной фазе во время азеотропной

33 перегонки, что может привести к образованию смесей диацетила и бенз::ла, которые затрудняют регенерацию бе.;— зола, использованного для аэеотропной перегонки.

Варка пива включает ферментацию сусла подходящим видом дрожжей, например, Saccharomyces cerevisiae или

Saccharomyces carlsfergensis.

Ферментацию ведут в две стадии: основная ферментация, которая длится

7-10 дн и вторичная ферментация процесс созревания, который может длиться 3-12 нед. Во время основной ферментации большая часть углеводов в сусле превращается в этанол и двуокись углерода. Созревание проводят при низких температурах в присутствии небольшого остаточного количества дрожжей. Целью созревания является осаждение нежелательных высокомолекулярных соединений и превращение диацетила, 2,3-пентадиона, Ы-ацетолактата и -ацето-Ф-оксибутирата в такие соединения, как диоды, которые не изменяют запаха и вку:.

Например, бутандиол — конечный продукт превращения 8 -ацетолактата и диацетила в пиве — не влияет на вкус и запах в концентрациях ниже 500 "./ë, Ферментные и химические реакции важные для содержания в пиве диацетила можно проиллюстрировать на следующей схеме: (5) (a Kem0-ð- окгии305алеращ)

CHg н с — он — н с — с-н ! с — он н — с- н

1 1

С0ОН ОООН (e p-диоксыяобамершп1 (балин) НЗС вЂ” с= О !

С вЂ” ОН !

СООН б-aаевСл а (61

С!Н3

В С вЂ” С вЂ” ОН !

С !

СООН и c— - с=о ! (доацещия)

НЗС (2)

1 н,с--с — он

I (ацеаоын )

И с — С= О м ! нс — с — он (2,3 — Бутан диод)

НЗ

Н

3 1ЗО3

Предшественник диацетила d. — ацетолактат вырабатывается в ферментирующих дрожжах за счет катализируемой ферментом конденсации пирувата и тиаминпирофосфата ацетальдегида и является промежуточным соединением в биосинтезе аминокислоты валина. +-Ацетолактат может таже самопроизвольно разлагаться через окислительное декарбоксилирование до образования ди- 10 ацетила, реакция (1), который затем восстанавливается редуктазами в клетках дрожжей во время процесса вызревания пива. Декарбоксилирование

<-ацетолактата является реакцией, 15 которая зависит от температуры и протекает относительно медленно при низких температурах, тогда как последуюшее превращение диацетила в ацетоин и 2,3-бутанди<щ происходит отно- 20 сительно быстро, вследствие чего стадией, определяющей скорость удаления «--ацетолактата и диацетила из пива, является декарбоксилирование диацетильного предшественника. Анало-25 гично стадией, определяющей скорость удаления 2,3-пентандиола и о -ацето-Д;аксибутирата, является спонтанное декарбоксилирование 2,3-пентандионового предшественника. 30

Для достижения максимального осаждения высокомолекулярных продуктов и получения пива хорошего качества вызревание должно происходить при наиболее возможно низких температурах, .З5 например О С. При этойтемпературе оно может происходить несколько месяцев, прежде чем полностью удалится ацетолактат, и образовавшийся диацетил восстановится дрожжами. Однако время 40 вызревания можно уменьшить, если предоставить возможность процессу протекать при более высоких температурах, например, до 1-2 нед при о D

10 С, или 1-2 нед при 5 Силн 1 или 2нед - 45 при -1 "С. Такая процедура ускоряет превращение ацетолактата в диацетил.

Медленного разложения ацетолактата до диацетила, реакция (1) на схеме можно избежать, используя для разло- 50 жения ацетолактата ферменты. Для этой цели можно использовать любые ферменты. Все сводится к декарбоксилированию ацетолактата до ацетона, реакция (4). 55

Целесообразно осуществлять превращение ацетолактата в --кето-р -оксиизовалерат с помощью изомеразы, 033 4 реа,öèÿ (6), или превращение ацетолактата в < P-oêñèèçîâàëåðàò с помощью редукто-изомеразы, реакция (5) .

Продукты реакции в обоих случаях являются предшественникамиаминокислоты валина.

Сусло обрабатывают ферментом, превращающим ацетолактат во время и-.и после ферментации. Примером фер-: мента является ацетолактатдекарбоксилаза, которую можно выделить из микроорганизма Aегоbacter aегоgenes.

Ацетолактат ферментативно декарбоксилируют до ацетоина, в результате удается избежать образования сильно пахнущего нежелательного диацетила из ацетолактата. Разложение с -аце" толактата до диацетила удается избежать за счет превращения предшественника диацетила с помощью ацетолактатных редукто-изомераз или изомераз, реакции (5) и (6) .

Ацетолактатдекарбоксилазу можно добавлять во время основной ферментации или во время процесса созревания. Применение этого фермента приводит к значительному сокращению времени созревания, так как ацетолактат быстро декарбоксилируется до пригодного для ферментации ацетоина без какого-либо образования диацетила, фермент можно добавлять перед или во время основной ферментации, где рН выше, нежели во время процесса созревания.

Вместо использования фермента в свободном состоянии его можно использовать в иммобилизованном состоянии, причем иммобилизованный фермент добавляют к суслу во время или при продолжении ферментации. Иммобилизованный фермент можно также хранить в колонке, через которую пропускают ферментируемое сусло или пиво. Фермент можно иммобилизовать отдельно или использовать совместно иммобилизовачные дрожжевые клетки и ацетолактатдекарбоксилазу.

Применение иммобилизованного фермента позволяет ускорять продолжительность получения пива, так как ферментацию пива можно осуществлять, пропуская сусло через колонки, содержащие иммобилизованные дрожжи и иммобилизованные ферменты, необязательно в совместно иммобилизованном состоянии. Если процессы основной ферментации и созревания объединяют для

1ЗОЗО непрерывного превращения сусла в готовое пино, производительность зависит от объема и диаметров колонн, Такой процесс уменьшает затраты труда и снижает себестоимость продукции. 5

Предлагаемый способ можно использовать не только для приготовления пива, но и для изготовления вина, где достигаются аналогичные преимущества, в частности снижение времени 10 вызревания и упрощение процесса. Ин" терес представляет использование ферментов, превращающих ацетолактат в связи с так называемой "Malolactic ферментацией. Этот способ, который осуществляют с помощью таких микроорганизмов, как виды Leuconostoc, Lactobacillus или Pediococcus, осуществляют после основной ферментации вина для повышения рН продукта, 20 также как и его биологической сТа бильности и для улучшения аромата вина. Однако такой способ может стать причиной потери аромата за счет диацетила, образование которого может 25 быть понижено с помощью ацетолактпревращающего фермента. Способ можно использовать при промышленном производстве этанола так, как продукты ферментации, которые получают и при З0 этом не содержат или практически не содержат диацетила, что упрощает процесс дистилляции в случае азеотропной перегонки для получения абсолютированного этанола, т.е. чистого 35 безводного этанола.

Ацетолактаткарбоксилазу можно выделить, например, иэ Aегоbacter

aегоgenes Однако можно также испольэовать и ацетолактат-превращаю-. 4p щие ферменты, полученные из других источников, например, видов Bacillus, Entегоbacter, Klebsiella, Leuconostoc, Serratia u Streptococcus и некоторых видов Actinomycetes и грибков, Подходящие ацетолактактные редукто-иэомеразы и изомеразы можно вьщелить иэ бактерий, таких видов, как

Е. Coli или Aегоbacter aегоgenes или иэ Neurospora crassа, дрожжей Salmo

nella или растений. Так как рассматриваются ферменты в аминокислотном ме таболи э ме, следуе т ожидать их наличия почти во всех живых клетках.

Если процесс спиртовой ферментации 55 происходит при рН в интервале 4-5, а многие легко доступные ацетолактатдекарбоксилазы, выделенные из микроорганизмов, обладают оптимальной зз 6 стабильностью и активностью при рН выше 5, целесообразно использовать ацетолактатдекарбоксилазу в химически модиФицированном состоянии для получения высокой стабильности и/или ог.— тимальной активности в интервале рН

4-5.

Пример 1. Порционная ферментация и быстрое созревание пива ! с использованием ацетолактатдекарбоксилазы.

1 л стерильного сусла из сусла крепостью 10,7 Р инокулируют пивными дрожжами Saccharomyces carlstergensis в количестве 20х10 клеток 1 л. Спус6 а тя 6 дн при 10 С процесс основной ферментации заканчивается, причем ослабление пива определяется как

2,0 Р. Содержание свободного и связанного диацетила (т.е. диацетила, полученного из с -ацетолактата) в пиве определяют как 0 12 и О,/1 ч./млн.

Затем пиво декантируют от выпавших в осадок дрожжей и смешивают со 100 мл

ll ll

Kreusen, т.е. интенсивно ферментированного пива, полученного из сусла, инокулированного дрожжами за 48 ч до этого. Более того, добавляют 25 мг ацетолактатдекарбоксилазы, выделенной из Aегоbacter aегоgenes. После

24 ч выстаивания при 1О С для вторичного ферментирования и созревания определяют содержание свободного и связанного диацетила как 0,05 и

0,10 ч./млн соответственно. Затем пиво охлаждают до -1 С и оставляют выстаиваться в течение двух дней при этой температуре, а затем готовое пиво фильтруют, Пример 2. Непрерывная ферментация и быстрое созревание пива.

250 г пивных дрожжей Saccharomyces

carlsbergensis, выделенных центрифугированием, суспендируют в 350 мл

З -ного стерильного раствора натрийальгината. Эту смесь по каплям добавляют к 10 л стерильного О, 1 M СаС1 для желатинизации альгината кальция с образованием сферических, содержащих дрожжи частиц диаметром около

3 мм.

Их оставляют выстаиваться в раст-. воре хлористого кальция в течение

12 ч при 4 С, а затем набивают в колонку диаметром 10 см и высотой 5 см.

Через этот реактор прокачивают стео рильное сусло при 10 С со скоростью

0,15 л/ч причем крепость сусла составляет 10,7 Р. Ослабление злюата на

7 (3030 выходе из реа!гтора 2, 1 Р, à поданным газовой хроматографии, содержание свободного и связанного диацетила

0,15 и 2,21 ч./млн соответственно.

К (л пива из реактора добавляют

25 мг ацетолактатдекарбоксилазы. Пиво оставляют выстаиваться при 10 С в течение 24 ч, а затем прокачивают через другой реактор с иммобилизован— ными дрожжами, так что время пребы- 10 вания составляет 5 ч. Содержание свободного и связанного диацетила в элюате определяют как 0,05 и 0,10 ч./млн соответственно. Затем температуру понижают до -1 С и после выстаивания 15 в течение двух дней при этой температуре готовое пиво декантируют от осадка и окончательно фильтруют.

Пример 3. Порционная ферментация и быстрое созревание пива с 20 применением ацетолактатной редуктоизомеразы.

1 л стерильного сусла ферментируют

Saccharomyces carlsbergensis, как описано в примере (. После 6 дн ос- 25 новной ферментации содержание в пиве свободного и связанного диацетила по определению составляет О, 10 и

0,61 ч./млн соответственно. Пиво декантируют от остаточных дрожжей и !

1 добавляют 100 мл "Kreusen, как описано в примере t вместе со 100 мг

4 -ацетолактат-редукто-изомеразы, полученной из Е. coli. Затем пиво оставляют выстаиваться в течение еще

24 ч при 10 С, после чего определяют содержание в нем свободного и связанного диацетила, которое составляет

О 03 и О 09 ч./млн соответственно.

Э о

Затем пиво охлаждают до — 1 С и ос- 10 тавляют выстаиваться на 2 дн при этой температуре, а затем готовое пиво фильтруют. (3

Дрожжевой эксгракт 10 (риптоза 10

Культивирование ведут в бродильном чане емкостью 20 л при 37 "С и аэрации, клетки собирают в среднеэкспоненциальной фазе путем цснтрифугиронания и.затеM промывают два раза фосфатным буфером при рН 6!8. Затем биомассу суспендируют в 20 мМ фосфатном буфере при рН 6,8 и гомогенизируют в гомогенизаторе МантонГаулина при 600 атм. Разрушенные клетки затем удаляют центрифугированием и во всплывший при центрифугировании слой добавляют ионообменную смолу ДŠ— 52, которую загружают в колонку и фермент элюируют фосфатом концентрацией от 20 мМ до 0,6 М при рН 6,8. Фракции исследуют на ферментную активность, активные фракции обьединяют и к ним добавляют сульфат аммония в количестве 0,6 г/мл.

Перед использованием фермента в процессе необходимое количество этой суспензии в сульфате аммония центрифугируют и полученный осадок раство ряют в 20 мМ фосфатном буфере при рН 6,8 и подвергают диалиэу на фоне того же буфера.

Иммобилизованные дрожжевые клетки

Saccharomyces cerevisiae вводят в виноградный сок, содержащий примерно

107 сбраживаемых карбогидратов. После 2 дн брожения свежеприготовленный раствор ацетолактатдекарбоксилазы добавляют в бродящую среду при концентрации 40 кЕ/л, после чего брожение продолжают еще 5 дн. Содержание ацетолактата вместе со свободным диацетилом в содержащем фермент растворе определяют и оно составляет

0,10 ч./млн.

Пример 4. Получение фермента, способствующего созреванию вина.

Микроорганизмы Aегоbacter aегоgenes культивируют в 1 л среды, содержащей, г:

55

КН Ро„ ! (а НР0, -12Н 0

Na д0

NaC1

MgS04 7}(0

СаС1 6Н 0

FeS0 7((0

MnC1 . - !Н 0

Глюкоза

1,5

9,0

1,5

1,5

О, 15

0,45

0,02

0,01

90 (l р и м е р 5. Этот пример иллюстрирует иммобилизацию ацетолактатной декарбоксилазы в матрице геля альгината кальция. Влажные клетки штамма Bacillus Licheniformis, генерирующие ацетолактатную декарбоксилазу (50 г влажных клеток), сусг!ендируют в 50 мл 0,9Х-ного раствора хлористого натрия. В образовавшуюся суспензию добавляют 100 мл 47-ного раствора альгината натрия, после чего полученную смесь по каплям переносят в О, 1 M раствор хларида кальция. Таким образом, получают небольшие гранулы альгината кальция, содержащие ацетолактатную декарбоксила3 10 ацетолактата и свободного диацетила с 1,9 до 0,10 ч.млн, Ф ор мула из об ре те ни я

2. Способ по и. 1, отличаюшийся тем, что фермент исполь20,зуют в иммобилизованном виде.

34 Спосоо по пв 1 9 о т л и ч а ю шийся тем, что дрожжи используют в иммобилиэованном виде.

4. Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что ацетолактатдекарбоксилазу используют в химически модифицированном виде для обеспечения стабильности и/или активности ее при значении рН среды 4-5.

Составитель А. Ульянова

Редактор Н. Рогулич Техред,Д.Олейник Корректор M. Самборская

Заказ 1228/58 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие„ г. Ужгород, ул. Проектная, 4

9 130303 зу. Эти гранулы промывают 3 раза порциями по 500 мл фосфатного буфера при рН 7 и затем используют аналогично .примеру 1.

Пример 6. Влажные, свежепри- 5 готовленные клетки Bacillus Lichenifoxmis (50 г), производящие ацетолактатдекарбоксилаэу, суспендируют в 250 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,0. Эту суспензию тщательно пере- 10 мешивают нри охлаждении до 5 С и при этой температуре в течение 30 мин по каплям добавляют 50 мл фосфатного буфера, содержащего 2,5Х глутарового альдегида. Реакционную смесь затем 15 выдерживают в течение 3 ч при 5 С, после чего клетки, содержащие ацетолактатдекарбоксилаэу, удаляют из реакционной смеси путем центрифугирования. В последующем эти клетки промывают 5 раэ порциями по 250 мл фосфатного буфера, Полученный химически модифицированный фермент используют согласно предлагаемому способу, при этом химически модифицированный фермент проявляет превосходную стабильность по сравнению с немодифицированным ферментом, причем рН находится в интервале 4-6.

Предлагаемый способ позволяет cor- 30 лано примеру 4 снизить содержание

1. Способ получения ферментированных спиртовых напитков, предусматривающий ферментацию сусла дрожжами, созревание его и введение в процессе ферментации или после него, или в процессе созревания фермента, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью снижения содержания диацетила, в качестве фермента используют ацетолактатдекарбоксилазу или иэомеразу, или редуктоизомеразу.