Способ стабилизации уреазы в растворе

 

Изобретение относится к способам стабилизации ферментов, содержащих SH-группы, а именно к способу стабилизации уреазы в растворе. Цель изобретения - упрощение и удешевление способа, а также удлинение срока сохранения активности фермента. Сущнос.ть изобретения заключается в том, то после обработки сефадексом к раствору уреазы в 0,01-0,06 М натрийфосфатном буфере добавляют в качестве стабилизатора зтилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) при соотношении 1:1-3 и дополнительно - сульфит натрия в количестве 10-100 мМ. Способ прост по технологии и позволяет удлинить срок хранения фермента в растворе при 23 С. 1 табл. а €

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (191 (11) А1 (5D 4 С 12 N 9/96

Т / у °:гг

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСИОМ,К СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3835242/31 — 13 (22) 02.01.85 (46) 30.04.8?. Бюл. Ф 16 (71) Институт биохимии АН ЛитССР (72) Ю.Ю.Кулис и Б.С.Куртинайтене (53) 557.15(088.8) (56) Lynn К.R. Some Properties and

Purification of urease. Biochem .

et Hiophys Acta, 1967, 146, 205-218..Промышленная методика на производство ферментного препарата уреаза.

Вильнюс, НПО "Фермент", 1982.

Авторское свидетельство СССР

В 743600, кл. G 0 1 N 31/22, 1976. (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ УРЕАВЫ В

РАСТВОРЕ (57) Изобретение относится к способам стабилизации ферментов, содержащих

SH-группы, а именно к способу стабилизации уреазы в растворе. Цель изобретения — упрощение и удешевление способа„ а также удлинение срока сохранения активности фермента. Сущность изобретения заключается в том, то после обработки сефадексом к раствору уреазы в 0,01-0,06 M натрийфосфатном буфере добавляют в качестве стабилизатора зтилендиаминтетрауксусГ ную кислоту (ЭДТА) при соотношении

1:1-3 и дополнительно — сульфит натрия в количестве 10-100 мЯ. Способ прост по технологии и позволяет удли- Ю нить срок хранения фермента в раство0 ре при 25 С. 1 табл.

1306953

Изобретение относится к способам стабилизации ферментов, содержащих БНгруппы, а именно к способу получения стабилизированной уреазы, которая находит применение при определении Мочевины.

Фермент уреаза нестабилен при длительном хранении в холодильнике или комнатной температуре„ Хранение уреазы в растворенном виде приводит к быстрой потере активности фермента, что снижает воэможность его использования для анализа мочевины в биологических жидкостях.

Цель изобретения — упрощение и удешевление способа, а также удлинение срока сохранения активности фермента.

Способ осуществляют следующим образом.

К раствору предварительно обработанной сефадексом уреаэы в фосфатном буфере в качестве стабилизатора помимо 1 мм этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) добавляют сульфит натрия в количестве 10-100 мМ. Величина.рН раствора 6,8. Она является оптимальной для активности уреазы и поддерживается 0,01-0,06 М натрийфосфатным буфером.

Эффект стабилизации в присутствии сульфита натрия обусловлен тем, что он восстанавливает частично окисленные при хранении БН-группы уреазы.

Сульфит натрия не может быть заменен каким-либо другим анионом по той причине, что сульфит вступает в реакцию расщепления S-S связи (в данном случае смешанного дисульфида белка и меркаптоэтанола) с освобождением

SH-группы. Внутренние Б-Б связи белка имеют низкую реакционную способность по отношению к сульфиту из-за стерических помех ° Влиянием стерических факторов объясняется предпочтительная атака сульфит-иона на одном из атомов серы в несимметричных дисульфидах.

Реакцию восстановления дисульфидной связи осуществляют и другие реагенты: гидрид-ионы, арсенит, цианид, тиосульфат и др. Однако сульфит является более реакционноспособным, чем тиосульфат, и неядовит в отличие от цианида, арсената и др. Гидрид-ион может разрушить и внутренние S-S связи вследствие высокой реакционноспособности.

f5

Другое использованное свойство сульфита — способность удалять из раствора фермента кислород.

Фермент уреаза является белком с четвертичной структурой, поэтому стабильность в некоторой мере зависит от ионной силы буфера. Известно, что при концентрации фосфата натрия в буфере 0 01 M активность уреазы составляла 14 ед/мг (63 ), а при концентрации 0,06 M — 22 ед/мг. При увеличении концентрации фосфата выше 0,1 М активность несколько уменьшается и составляет 80-90_#_.

Стабилизирующее действие этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) объясняется тем, что она связывает ионы металлов, являющихся катализаторами окисления, молекулярным кислородом важных для активности фермента тиоловых групп.

Предварительная обработка уреаэы сефадексом согласно известному способу обеспечивает обессоливание фермента и удаление неподдающихся стабилизации примесей,, вследствие чего повышается начальная активность подвергаемой стабилизации уреазы (от активности продажной уреазы 30-50 до 90 и более Е/мг), а также ее стабильность.

Предлагаемый способ стабилизации уреазы, являющийся более простым по своей технологии осуществления и.более дешевым по используемым в качестве стабилизаторов веществам, позволяет удлинить сроки сохранения урео азной активности в растворе при 25 С.

Пример 1. 100 мг продажной уреазы растворяют в 3,5 мл 60 мМ фосфатного буфера, рН 6,8, фильтруют чере 3 колонку, заполненную 150 мл геля сефадекса < =200, предварительно уравновешенного фосфатным буфером рН 6,8, содержащим 1 мМ ЭДТА и 1 мМ меркаптоэтанола (МЭ). Элюируют тем же буфером. Активную фракцию подвергают стабилизации и испытанию на стабильность при хранении при 25 С. Конто рольный образец (1 мл очищенной уреазы,концентрация которой 0,2 мг/мл) разбавляют 9мл фосфатного буфера рН=6,8.

Для стабилизации берут 1 мл раствора очищенной уреазы (концентрация

0,2 мг/мл, удельная активность

90, l E/ìã), к нему прибавляют 9 мл фосфатного буферно.-о раствора (60 мМ, рН 6,8), содержаще:.о 1 MM ЭДТА и от 1 I306953 4

Зависимость уреазной активности (в Х от начальной) от концентрации сульфита натрия при хранении приве дена ниже. до 100 мМ сульфита натрия, и расто вор оставляют в термостате при 25 С.

Периодически измеряют активность уреазы, отбирая по О, 1 мл раствора.

Концентрация

Na SO, мМ

О 1 2 10 20 30 50 100

62 65 86 90 89 100 99 92

Уреазная 4 сут активность после хранения 120 сут при 25 С, Х

4,3 — — 32,9 — 43 — 40

Наибольший стабилизирующий эффект !

5 дает применение сульфита натрия в интервале концентраций от 10 до 100 мМ: на 4-е сут хранения активность уреазы почти не меняется, после 4-месячного хранения остаточная активность составляет 33-43Х. В то же время контрольный образец после 4 сут теряет

38Х начальной активности, а после

4 месяцев она составляет только 4,3Х.

Время полужизни препарата, содержащего сульфит натрия в концентрации

30 мМ и сохраняющего 43Х уреазной активности после 4-месячного хранения о при 25 С, составляет 96 сут. Дальнейшее увеличение концентрации стабилизатора приводит к подщелачиванию среды и, следовательно, к снижению уреазной активности из-за несоответст- :вия рН раствора рН-оптимуму фермента. о

Время хранения при 25 С, сут

Состав среды

О 2 7 15 41 53

35,9 29,5 4,08

1,89 0

100

1 Вода

2 30 мМ Na 80 Н 0

20,8

37,4

35,7

100 100 00

3 30 мМ Na SO 1 мМ ЭДТА Н О 100 100

83,3

58,2

41,7

100

14,4 11, 7

18,8

23,2

100

64,2

74, 1.

85,2 76,5!

00 100

100 — 42, 7 27, 7 26,6 30

Из таблицы видно, что при добавлении стабилизирующих компонентов.4 1 мМ МЭ 1 мМ ЭДТА Н О

5 30 мМ Na SO 1 мМ ЭДТА

60 мМ Na-P буф. рН 6,8

6 Глутатион, тринатрий цитрат, ЭДТА, уреаза (1:1:1:1), вес.ч., Н 0

Пример 2. 100 мг сухой уреазы очищают на колонке с сефадексом =200 аналогично примеру 1. К 0 5 мл очищенной уреазы (концентрация О, 15 мг/мл, уд. активность 70, 1 Е/мг) приливают воды до 10 мл (раствор 1 — контрольный препарат).

Аналогично готовят ферментные препараты в растворах 2-5, в которых содержатся различные стабилизаторы.

Стабилизированный состав по прототипу растворяют в воде (препарат 6).

Все образцы подвергают испытанию на стабильность при хранении в термостате при 25 С.

Состав растворов, время хранения и уреазная активность в Х от начальной приведены в таблице.

1 начальная активность фермента не изменяется. Препарат 5, в составе ко1306953

Составитель Е.Воробьева

Редактор М.Бандура Техред В.Кадар Корректор А.Зимокосов

Заказ 1498/24

Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб... д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ..ri.11poåêòíàÿ, 4 торого содержится сульфит натрия и

ЭДТА в натрий-фосфатном буфере, рН

6,8, теряет 507 начальной активности при 25 С в течение 82 сут. Фер0 ментные препараты в составах 2 и 3, содержащих соответственно только сульфит натрия в воде или сульфит натрия и ЭДТА в воде, являются менее стабильными по сравнению с ферментным препаратом в составе 5. При от- 1О сутствии сульфита натрия (раствор 4) стабилизирующий эффект еще меньше.

Контрольный образец уреазы, растворенной в дистиллированной воде (состав 1), теряет половину активности 15 менее чем за 12 ч.

Таким образом, стабильность уреазы в растворе 5, приготовленном согласно изобретению, превышает ее ста- 20 бильность в растворах, содержащих от- дельные компоненты. Она также в 2 раза превышает стабильность состава по прототипу в водном растворе (препарат 6). 25

Стабилизированную предложенным способом уреазу использовали для приГотовления ферментной уреазной мембраны, применяемой при определении мочевины. ЗО

Пример 3. Приготавливают

3 образца уреазных мембран по известной методике. Уреазу предварительно очищают на колонке с сефадексом 1 =200 (как указано в примере 1), затем смешивают ее с раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере следующим образом:

Образец 1: 100 мг альбумина;

0,7 мг (0,2 мл) уреазы; 40

1,0 мл (10 мМ Na-фосфатного буфера рН

7,0-7,2.

Образец 2: 100 мг альбумина;

0,7 мг (0,2 мл) уреазы;

1,0 мл 10 мИ Иа-фосфатного буфера рН 7,0-7,2; мМ меркаптоэтанола и 1 мМ ЭДТА.

Образец 3: 100 мг альбумина;

0,7 мг (0,2) уреаэы;

1,0 мл 10 мИ Na-фосфатного буфера рН 7,0-7,2; эО мМ Ма SO и 1 мИ

ЭДТА.

В каждую иэ трех смесей добавляют по 0,03 мл 25Х глутарового альдегида.

Полученную смесь выливают на стеклянные пластинки размером 6х6 см и оставляют для иммобилизации в холодильнике при +4 С в течение 5 ч, после чего готовые мембраны промывают водой и хранят в холодильнике каждую мембрану в буферном растворе с соответствующими добавками. После 4-месячного хранения при 4 С проверяют о уреазную активность: мембрана 3 сохранила 96% начальной уреазной активности; мембрана 1 — 42X, а мембрана 2 — 327 начальной активности.

Формула изобретения

Способ стабилизации уреазы в растворе путем добавления к исходному ферменту, предварительно обработанному сефадексом, в качестве стабилизатора этилендиаминтетрауксусной кислоты при соотношении фермента и ЭДТА

1:(1-3),о.тличающийся тем, что, с целью упрощения и удешевления способа, а также удлинения срока сохранения активности фермента, исходный фермент помещают в 0 01—

0,06 М натрий-фосфатный буфер„ а в полученный раствор в качестве стаби— лизатора дополнительно вводят сульфит натрия в количестве 10 †1 мИ.