Способ определения пролиферативной способности клеток

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается оценки качества культуры клеток, их способности к размножению Цель изобретения заключается в упрощении и обеспечении большей оперативности определения пролиферативной способности (ПС) клеток, Устанавливают зависимость между степенью набухаемости клеток, погруженных в гипотонический раствор, и их ПС« Для определения ПС культуру клеток выдерживают в течение 20-30 мин в изо-и гипотоническом растворе,после чего измеряют клетки под микроскопом, . Определяют угол наклона прямой зависимости размера клетки от гипотоничности раствора к оси абсцисс и по формуле определяют ПС. 4 ил.,4 табл. (/) 00 оо 00 со

„.Я0„„1331891 А1

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51) 4 С 12 М 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3898953/28-13 (22) 17.05.85 (46) 23.08.87. Бюл. У 3 1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной-биохимии (72) О,А. Бочарова, Г.Н. Зацепина и Д.В, Зыбин (53) 576.35(088.8) (56) Голубев Д.Б., Сомнина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. Л.: Медицина, 1976.

Зацепина Г.Н., Тарасова И.M.

Толох И.Д. Термодинамический потенциал воды в лимфоцитах животных в различных состояниях жизнедеятельности.—

Журнал физической химии, 1984, Ó 8, с. 2103-2105.

Santera J.J. The Rotary Columu

"Method for Growth of Large-Scale

Quantatities of Cell Mondayer S.

Bioengineering, 1972, v. XIV, N- 5, р. 753-775. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ СПОСОБНОСТИ КЛЕТОК (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается оценки качества культуры клеток, их способности к размножению. Цель изобретения заключается в упрощении и обеспечении большей оперативности определения пролиферативной способности (IIC) клеток.

Устанавливают зависимость между степенью набухаемости клеток, погруженных в гипотонический раствор, и их

ПС. Для определения ПС культуру клеток выдерживают в течение 20-3О миь" в изо-и гипотоническом растворе, после чего измеряют клетки под микроскопом.. Я

Определяют угол наклона прямой зависимости размера клетки от гипотоничности раствора к оси абсцисс и по формуле определяют ПС. 4 ил.,4 табл.

1331891

Продолжение табл. 1

14, 1+0,3

14,9+0,3

15,9+0,3

5 1/2,5

1/3

Таблица 1

i2 5+0,3

13,4+0,2 I /15

Таблица 2

Время, мин, в растворе с

Т= 1/2

Диаметр клеток, мкм в растворе с 7=1

Индекс пролиферации (экспериментальный) 1

25 30

3,4+0,8

5,8 0,6

6,9+0,8

12,9+О, 1*

12,6+0,2

10,3+0,2

13,6+0,2 13,2+0,2 13,6+0,3

13,5+0,2

74,2+0,1

13,3+0,3 14,3+0,2 14,0+0,1

11,5+0,2 12,8+0,2 13,8+0„2 13,6+0,2 13,8+О, 1

*Везде приведены ошибки среднего значения определяемой величины диаметра клеток.

Из табл. 2 видно, что стационарное состояние дпя всех клеточных популяций устанавливается через 20 мин.

Поэтому время экспозиции для определе- . ния степени набухаемости клеток выбрано в интервале 20-30 мин.

Зависимость размера клеток (d) от степени разбавления физраствора (1/ Н ) имеет линейный характер, что позволяет определять тангенс угла наклона (фиг. 1).

Для определения зависимости степени набухаемости (tg 3) клеток различных популяций от их пролиферативной способности () вначале определяют средние размеры 100-750 клеток каждой популяции после 30-минутной инкубации их в физиологическом (1 = 1) Изобретение относится к биотехнологии и касается оценки качества культуры клеток с точки зрения их способности к размножению.

Цель изобретения заключается в ускорении процесса определения пролиферативной способности, Пример 1. При попадании клетки в гипотонический раствор она вначале ведет себя как осмометр. Затем вступает в действие активная система осморегуляции, которая способствует прекращению разбавления клеточного содержимого. В результате устанавливается некоторое стационарное состояние набухших клеток.

Зависимость линейных размеров клеток суспензионной культуры ВНК-21 от степени разбавления физиологического раствора (0,85Ж NaC1) деионизованной водой приведена в табл. 1. Разбавление более, чем в 3 раза нецелесообразно, так как клетки лопаются.

-. и - осмотическое давление раствора, выраженное в относительных единицах: 1 — осмотическое давление физиологического раствора;

**d — средний диаметр клетки,мкм;

+m — ошибка среднего.

На фиг. 1 представлены количественные параметры прямой набухания для клеточной популяции культуры

ВНК-21, имеющей экспериментальный индекс пролиферации 5,55 0,6.

Экспериментальный индекс пролиферации i определяют как отношение концентрации клеток после культивирования к посевной концентрации, Культивирование проводят на модифицированной среде Игла в колбах емкостью

250 мл при 100 мл заполнения на качалке фирмы New-Brunswick при 180 об/мин в течение 72 ч при 36,2+0,2 С.

Время экспозиции клеток в гипотонических .растворах определяют экспе30 риментально. Динамика набухания клеток разных популяций во времени (для

Г = 1/2) дана в табл. 2. з 1331891 4 и гипотоническом (У = 1/2) растворах. Далее, одним иэ методов линеариэа:В аликвотных частях клеточных популя- ции параметров, а именно методом ска- ,ций определяют индексы их пролифера- . нирования сеток, находят коэффициен;. тивной "активности. По результатам из- ты К„ = 7,6 и К, = О, 12 применительно мерений размеров клеток строят пря- к культуре ВНК-2 l мые зависимости d от 1/Т для опре- Таким образом, получают уравнение деления tg g (фиг. 2). Результаты следующего вида, которое описывает измерения ip, d и й8 для клеток кривую на фиг. 3: различных популяций приведены в

10 табл. 3.

0,1 + tg)

Затем для определения характера Данное уравнение и его графическое зависимости i от tg .(Строят отобр ение служат основой д я опреP э кап кривую, показанную на фиг. 3, П,лу деления пролиферативной способности.

I ченная кривая имеет насыщающий харакКоличественные параметры прямых тер и описывается уравнением, общий набухания и соответствующие индексы вид которого пролиферации для экспериментов с оду к1. х ним разведением физиологического ра+ х створа сведены в табл. 3.

Таблица 3 а

1р веспер

d мкм, im (ошибка среднего) мкм

+f0

Прямая по графику

13, 710,2

13 7+0 2

13 5+0 2

13, 9+0,3

14,2+0,1

15 4+0,2

13,8+0,1

13,6+0,2

13,5+0,2

12,9+0,1

12, 8+О, 1

12, 610,2

12,0+0 6

10,3+0,3

1, 1 0,2

1,7+0,2

3,410,8

4,840,7

5,8+0,6 ,6,810,7

6,9+0,8

0,04

0,13

0,22

0,32

0,68

0,76

Примечание: 1,3 5 6

Экспериментальные данные, представленные графически на фиг. 2; средний диаметр клеток, помещенных в физиологический раствор (й = 1); средний диаметр клеток, помещенных в гипото" нический раствор, (.Г= 1/2); тангенс угла наклона прямых набухания; индекс пролиферации, полученный в результате культивирования соответствующих клеточных популяций как отношение конечной концентрации к посевной; количество экспериментов для каждого случая.

tg o(р экстер

П р,и м е р 2. Определяют пролиферативную способность нескольких популяций клеток суспензионной культу-. ры ВНК-21, хранившихся в холодильнике при температуре +4 С в течение 4 сут.

Исследуемые популяции ресуспендируют и выдерживают в течение 30 мин. в физиологическом растворе (Г 1), физиологическом растворе, разбавленном

55 водой вдвое (е = 1/2) и в растворе

3-кратного разбавления (.Ti 1/3) .

Апиквотные части культуры клеток культивируют описанным образом в течение 72 ч для экспериментального е

1331891 б тально по резупьтатам культивирования

{»Р экс ) °

Результаты сравнения двух методик

ПОКаЗЫВаЮт, ЧтО тЕОРЕтИЧЕСКИ (»р тео ) и экспериментально определенные значения (» р „ „ ) в пределах статической ошибки совпадают (табл.4). При среднем квадратичном отклонении изме10 ряемой величины диаметра клетки

3,0 мкм точность предлагаемого способа составляет 10-15Х.

Количественные параметры прямых набухания и соответствующие индексы пролиферации для экспериментов с двумя разведениями физиологического раствора отражены в табл. 4. определения индекса пролиферации (i „ „ ) как отношения конечных концейтраций клеток к посевным, После определения средних размеров клеток после 30-минутного суспендирования в гипотонических растворах строят график зависимости размеров

1 клеток (Й,мки) от разбавления (†-)

/I и определяют .tg d для каждой из популяций (фиг. 4). Затем по формуле определяют индекс пролиферативной способности (i, ), который сравнивают с индексом йролиферативной способности, определенной эксперименТаблица 4

dF +m .1 с1г +m,1з +ш

Прямая графика

12,0+0,3

12,8+0,2

13,6+0,2

1, 99+0, 22

2,43+0,35

3,94+0,65

5,24+0,5

5,55+0 6

5,42+0,4

12,3+0,3 0 05 l3 0+0,2 0,07

14,3+0,3 0,19

14,8+0,3 0,22

15,9+0 3 0,34

14,5+0,4 0,40

11,8+0,3

12,3+0,3

12,4+0,2

12,6+0,2

2,46

4,26

13,6+0,2

4,9

14, 1+0,3

13,8+0,3

12,5+0 3

4а

10, 3+О, 3

5 3

5,48 — экспериментальные данные, представленные графически на фиг. 4;

" средний диаметр клеток, помещенных в физиологический раствор .(6 = 1);

- средний диаметр клеток, помещенных в гипотонический раствор (Г = 1!2); — средний диаметр клеток, помещенных в гипотонический раствор с (n = 1/3); — индекс пролиферации, вычисленный по формуле и показывающий относительное увеличение количества клеток в случае культивирования; — индекс пролиферации, полученный экспериментально в результате культивирования в течение

72 ч как отношение конечной концентрации клеток к посевной. ьи р теор

1 р акссер

Формула изобретения

Способ определения пролиферативной способности клеток, предусматривающий инкубирование клеток в изотоническом растворе с последующим обсчетом результатов, отличающийся тем, что с целью ускорения процесса, клетки дополнительно инкубируют в гиП р и м е ч а н и е. 1,3,5

2tR d »р теор »р эксп потоническом растворе, при этом инкубирование в гипотони4еском и изотоническом растворах осуществляют в течение 20-30 мин, после инкубирования определяют размер клеток в каждом из растворов, а обсчет результатов осуществляют с учетом степени набухаемости клеток в каждом растворе.

iззiвы

d,ìêì

2 3

1331891

Фив. 3

Q мин

Составитель А. Семионов

Техред B.Êàäàð

Редактор Н. Егорова

Корректор Л. Пилипенко

Заказ 3770/23 Тираж 499

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул, Проектная, 4