Способ определения фосфолипидов

 

Изобретение относится к биохи- : мии, предназначено для биохимического анализа фосфолипидов биохимических препаратов и биологических объектов. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Для этого к пробе , содержащей фосфолипиды, добавляют четыреххлористый углерод. Затем раствор фосфолипидов обрабатывают ртутномолибденовьм реактивом, разведенным этиловым спиртом не менее чем вдвое, краситель берут в соотношении 1-2 мл на 10-100 мкг фосфолипидов. 3 табл. со со tsD tsd К 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (511 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3877256/28-14 (22) 01.04.85 (46) 23.08;87. Бюл. Ф 31 (71) Тбилисский государственный университет (72) М.А. Царцидзе, М.В. Гордезиани, Б.A. Ломсадзе и Н.А. Куциава (53) 616.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 907434, кл. G 01 N 33/48, 1982.

„„SU„„1332228 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ (57) Изобретение относится к биохимии, предназначено для биохимического анализа фосфолипидов биохимических препаратов и биологических объектов.

Цель изобретения — повьппение чувствительности способа. Для этого к пробе, содержащей фосфолипиды, добавляют четыреххлористый углерод. Затем раствор фосфолипидов обрабатывают ртутномолибденовым реактивом, разведенным этиловым спиртом не менее чем вдвое, краситель берут в соотношении 1-2 мп на 10-100 мкг фосфолипидов. 3 табл.

1332228

Изобретение относится к биохимии и физико-химической биологии и может быть использовано при биохимическом анализе фосфолипидов биохимических препаратов и биологических объектов.

Цель изобретения — повьппение чувствительности способа за счет использования в качестве красителя ртутномолибденового реактива, разбавленного 10 этиловым спиртом.

Способ осуществляют следующим образом.

К пробе, содержащий фосфолипиды, добавляют четыреххлористый углерод. 15

Затем раствор фосфолипидов обрабатывают ртутно-молибденовым реактивом, разведенным этиловым спиртом не менее чем вдвое.

Реактив готовят следующим обра- 20 зом.

Раствор А — это 16 r молибдата аммония в 120 мл дистиллированной воды; раствор Б — к 10 мл ртути прибавляют 40 мл НС1 и 80 мл раствора А. 25

В дальнейшем к остатку раствора А добавляют 200 мл концентрированной серной кислоты и полностью раствор Б.

При инкубации указанного реактива с этиловым спиртом получают темно-си- 30 ний раствор. При изменении времени инкубации изменяется окраска комплекса реактив — фосфолипид. Поэтому при количественном определении фосфолипидов необходимо строго соблюдать З5 время инкубации, при этом не имеет значения инкубируют смесь 10,16 или

24 ч. Важно, чтобы все опыты проводились на реактиве, полученном при определенном времени инкубации. 40 . Пример 1. Липиды из крови крыс экстрагируют 20-кратным объемом смеси хлороформ-метанол 2:1, два раза смесью 1:1 и затем осадок заливают этой же смесью 1:1 и оставляют на 45 ночь. На следующий день экстракцию липидов проводят еще дважды смесью хлороформ-метанол 2:1.

Объединенные липидные экстракты отмывают оТ водорастворимых примесей охлажденным раствором О,ЗН NaC1 добавлением с таким расчетом, чтобы верхний водный слой содержал не более

50 . спирта (чтобы он не извлекал фосфолипиды).

После центрифугирования верхний водорастворимый слой отсасывают. Пленку, образующуюся на поверхности раздела двух фаз (хлороформенной и водно-спиртовой) растворяют добавлением небольшого количества этилового спирта. Хлороформенный экстракт, содержащий фосфолипиды, упаривают досуха под вакуумом при комнатной температуре. Общее количество липидов определяют весовым методом, сухой остаток растворяют в органическом растворителе СС! из расчета, чтобы в 1 мл раствора содержалось до 100 мкг липидов.

Процесс выделения липидов и определения в них количества фосфолипидов проводят при комнатной температуре.

К липидам, растворенным в 5 мл

СС1, добавляют 1 мл красителя и инкубируют 10 мин на водяной бане при

60 С. Органическая фаза принимает голубую окраску. После разделения фаз к органической фазе прибавляют 60 ную серную кислоту и инкубируют 10 мин на водяной бане при 60 С для устранения мутности раствора (берется 60 ная серная кислота потому, что при низких концентрациях кислоты мутность органической фазы не исчезает, а 60 и вьппе уже дают прозрачные растворы комплекса в органической фазе). Разделяют фазы и через 30 мин в органической фазе определяют оптическую плотность комплекса краситель-фосфолипид при 670 нм. По стандартной кривой зависимости оптической плотности от концентрации фосфолипида определяют концентрацию фосфолипида в крови крыс.

Продолжительность процесса опреде ления 55-60 мин, чувствительность

10 мкг.

Пример 2. Проводят определение в стандартных растворах фосфолипидов так, как описано в примере 1.

В табл. 1 представлена зависимость оптической. плотности от концентрации фосфатидилхолина и смеси фосфатидилхолина и фосфатидилсерина, а в табл.

2 — от концентрации фосфолипидов при разных объемах красителя.

Пример 3. Проводят определение фосфолипидов в разных биологических объектах. Данные представлены в табл. 3.

Эти объекты исследуются и поэтому в табл. 1 приведены только данные о количестве фосфолипидов в них. Хо1332228

Фосфолипиды Оптическая плотность при концентрации, мкг

5 10 20 40 60 80 100 200 400

Фосфатидилхолин

0,0 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,22 0,23

Фосфатидилхолин + фосфатидилсерин

0,0 0,02 0,04 0,08 0,13 0,17 0,20 0,21 0,22

Таблица 2

10 20 40 60

Оптическая плотность при концентрации фосфолипидов, мкг

Объем красителя, мл

5 80 100 200 400 600 800 .

0,0 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,22 0,23 0,24 0,24

0,0 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,22 0,23 0,24 0,24

0,08 0,08 0,08 0,08 0,10 0,10 0,25 0,34 0,50 0,70 0,80

0,08 0,08 0,08 0,08 0,10 0,10 0,25 0,34 0,50 0,70 0,80

Т а б л и ц а 3

Продо

Митохондрий печени крыс

26018

Лизосомы печени крыс

Ф

Эритроциты крови человека

234+ 4

212+7

Aspergilus niger

80 5

Лимфоциты селезенки крыс

196i5 Aspergilus terues

ВНИИПИ Заказ 3826/40 Тираж 776

62+4

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 тя аналогичным образом можно опреде- ля, разделения фаз и последующего лить концентрацию фосфолипидов и для спектрофотометрирования органической других клеток и биологических мемб- среды, отличающийся тем, ран

5 что с целью повышения чувствитель,ности способа, в качестве красителя

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я используют ртутно-молибдейовый реактив, разбавленный этиловым спиртом

Способ определения фосфолипидов не менее чем вдвое, причем краситель путем растворения пробы в четыреххло- 10 берут в соотношении 1-2 мл на 10ристом углероде, добавления красите- 100 мкг фосфолипидов.

Таблица 1