Способ диагностики гемолитической болезни новорожденных

 

Изобретение относится к медицине, точнее к педиатрии и акушерству, предназначено для ранней доклинической диагностики гемолитической болезни новорожденных (ГЕН). Цель изобретения - повьшение точности и сокращение времени диагностики. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят тонкий мазок крови новорожденного , высушивают при 20-25 С, фиксирзпот 15 мин в холодном ацетоне (4 С). Фиксированный препарат п)эомывают в фиксированном физрастворе (рН 7,4), на него наносят комплемент, -разведенный физраствором 1:10. Инкубируют 20 мин при 37°С. Препарат отмывают проточной водой, ополаскивают в физрастворе . На влажный препарат наносят антикомплементарную сыворотку, меченную флюорохромами. Инкубируют 40 мин. Отмлвают препарат в трех порциях физраствора по 10 мин в каждой. Мазок заключают под покровное стекло в 90%-ный глицерин, разведенный, физраствором . Препарат просматривают в люминесцентном микроскопе при иммерсионном , увеличении. При наличии специфического свечения антикомплементарной сыворотки на оболочках эритроцитов диагностируют ГЕН. Метод позволяет выявит-ь ГБН в начальной стадии ее развития на доклиническс уровне. Метод прост, требует мало времени и трудовых затрат, в нем используется отечественная аппаратура и реактивы . & (Л с 00 DO 4 О со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (50 4 G Ot N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к авторском свидятельствм

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ. (21). 3758921/28-14 (22) 26.06.84 (46),30.08.87. Бюп. У 32 (71) Курский государственный медицинский институт (72) П.С.Гуревич, А.И.Осипов, А.В.Желябин, В.С.Барсуков и С.А.Ерина (53) 615.375 (088.8) ($6) Авторское свидетельство СССР

У 810223, кл. А 61 В 10/00, 1983. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОЛИТИЧЕС-:КОИ БОЛЕЗНИ НОВОРОЖДЕННЫХ (57) Изобретение относится к медицине, точнее к педиатрии и акушерству, пред. назначено для ранней доклинической диагностики гемолитической болезни новорожденных (ГБН) . Цель изобретения — повышение точности и сокращение времени диагностики. Для этого на обезжиренное. предметное стекло наносят тонкий мазок крови новорожденноо

ro высушивают при 20-25 С, фиксируют 15 мин в холодном ацетоне (4 С) .

Фиксированный препарат промывают.в

„SU„„1334079 А1 фиксированном физрастворе (рН 7,4), на него наносят комплемент, разведенный физраствором 1: 10. Инкубируют

20 мин при 37 С. Препарат отмывают проточной водой, ополаскивают в физрастворе. На влажный препарат наносят антикомплементарную сыворотку, меченную фпюорохромами. Инкубируют

40 мин. Отмывают препарат в трех порциях физраствора по 10 мин в каждой.

Мазок заключают под покровное стекло в 90Х-ный глицерин, разведенный. физраствором. Препарат просматривают в люминесцентном микроскопе при иммерсионном.увеличении. При наличии специфического свечения антикомплементарной сыворотки на оболочках эритроцитов диагностируют ГБН. Метод позволяет выявигь ГБН в начальной стадии ее развития на доклиническом уровне.

Метод прост, требует мало времени и трудовых затрат, в нем используется отечественная аппаратура и реактивы.

1334079

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в педиатрии и акушерстве для ранней доклинической диагностики гемолитической : .) болезни новорожденньх (ГБН) .

Цель изобретения — повышение точности и сокращение времени диагностики.

Поставленная цель достигается тем, 10 что в мазках крови ребенка выявляется фиксация комплемента на эритроцитах, что указывает на ГБН. Способ основан на патогенетических процессах, отражающих суть ГБН, — при реакции антител матери и эритроцитов плода происходит фиксация на эритроцитах комплемента и его активация.

Способ осуществляют следующим 20 образом.

На предварительно обезжиренное предметное стекло наносят тонкий мазок крови новорожденного (можно использовать пуповинную или перифери- 2В ческую кровь), высушивают при комнатной температуре и фиксируют в холодном (+4 С) ацетоне в течение 15 мин.

Фиксированный препарат ополаскивают в забуференном физрастворе (0,01 M 30 фосфатный буфер) рН 7,4) и на. него наносят комплемент, разведенный физраствором 1:10. Инкубируют во влажной као мере при 37 С в течение 20 мин. Затем препарат Отмывают протОчнОй BopoIIp0 . водной водой в течение 20-30 мин и ополаскивают в физрастворе. На влажный препарат наносят антикомплементарную сыворотку, меченую флюорохромами, в рабочем разведении, указанном на 4О ампуле, Инкубируют во влажной камере при комнатной температуре в течение

40 мин. Отмывают препарат в трех порциях фязраствора по 10 мин в каждой.

Мазок заключают под покровное стекло 45 в 90Х-ный глицерин, разведенный физраствором.

Препарат просматривают в люминесцентном микроскопе при иммерсионном увеличении. ГБН диагностируют при „„о наличии специфического свечения антикомплементарной сыворотки на оболочках эритроцитов.

Пример 1. У новорожденной К., родившейся 1б.02.84, группа крови

А (II) резус "+". У матери группа крови 0 (I) резус "-". К концу первых суток жизни у ребенка развилась желтуха.

Была заподозрена ГБН. Для исследования на пяти предметных стеклах нанесены тонкие мазки крови новорожденного, высушены и зафиксированы в холодном ацетоне. Препарат 1 после смачивания в физрастворе заключен под покровное стекло без обработки комплементом и антикомплементарной сывороткой (для контроля на аутофлюоресценцию) . Hpепарат 2 антикомплементарной меченой сывороткой без предварительной инкубации с комплементом (для выявления эндогенного фиксированного комплемента).

Препарат 3 обработан люминесцирующей сывороткой против иммуноглобулинов кролика (контроль на неспецифическую фиксацию меченых антисывороток). Препараты 4 и 5 обработаны раствором комплемента, затем препарат 4 обработан.люминесцирующей сывороткой против иммуноглобулинов кролика (контроль неспецифического связывания комплементом люминесцирующих антисывороток), а препарат 5 обработан меченой антикомплементарной сывороткой. Все препараты просмотрены под люминесцентным микроскопом. Выявлено специфическое свечение антикомплементарной сыворотки в препарате 5 и более слабое ее свечение в препарате 2 (за счет эндогенного комплемента). В других контрольных препаратах свечения нет. На этом основании была диагностирована ГБН.

Пример 2. У новорожденного

С., родившегося 20.02.84, группа крови А (II), резус "+". У матери группа крови О (I), резус "+". Роды преждевременные на сроке 32-34 недели. На вторые сутки появилась желтуха. Была заподозрена ГБН. Однако на основе известного способа диагностики ГБН врачами-акушерами этот диагноз не подтвердился и была установлена физиологическая желтуха новорожденных.

Для уточнения диагчоза проведены исследования, аналогичные описанным в примере 1. В препарате, обработанном комплементом и меченой антикомплементарной сывороткой, обнаружено специфическое свечение оболочек зритроцитов, Более слабое свечение антикомплементарной сыворотки имелось в препарате, не обработанном предварительно комплементом. В трех других контрольных препаратах свечения нет.

В данном случае предлагаемым спо!

334079 собом диагностирована ГБН по системе

АВО. Таким образом, предлагаемый способ позволяет более достоверно диагностировать ГБН.

Пример 3. У новорожденного

Б., родившегося 22.02.84, группа крови В (III) резус "+". У матери группа крови А (П), резус "+". К концу вторых суток у ребенка появилась жел- !О туха и была заподозрена ГБН.

Для установления диагноза проведены исследования, аналогичные описанным в примере 1. При просмотре препаратов в люминесцентном микроско- 15 пе ни в одном из них свечения не обнаружено. Таким образом, ГБН как причина желтухи отвергнута. Последующим клиническим обследованием установлено, что причиной желтухи явилась кефалогематома (желтуха вследствие рассасывания кровоизлияния).

Для проведения диагностического исследования от момента приготовления мазка крови до просмотра препаратов 25 в люминесцентном микроскопе требуется около 2 ч.

Таким образом, ГБН может быть точ1 но диагностирована без использования комплекса из 7 методик в более корот- до кий срок. Кроме того, предлагаемлй способ диагностики позволяет выявить

ГБН в тех случаях, когда известный комплекс методик не показывает наличия изоиммунологического конфликта (пример 2).

Было проведено исследование 73 новорожденных и их .матерей известным и предлагаемым способами.

У 40 детей клинически бып запо- щ дозрен изоиммунологический конфликт на основании наличия желтухи, а у 27, кроме того, имелась несовместимость крови матери и плода по резус-фактору или системе АВО. Известным способом ГБН была определена у 17 детей (42,57). Предлагаемым способом ГБН быпа диагностирована у 25 детей (62,57).

Способ диагностики гемолитической болезни новорожденных путем исследования крови, отличающийся тем, что, с целью повьипения точности и сокращения времени диагностики, мазок исследуемой крови, взятый в течение 1-3 суток жизни новорожденного, обрабатывают комплементом с последующим добавлением антикомплементарной люминесцирующей сыворотки и при выявлении специфического свечения ка поверхности зритроцитов диагностируют гемолитическую болезнь.

Кроме того, у двух детей, у которых известным способом определялась

ГБН, предлагаемый способ позволил отвергнуть установленный диагноз.

Дальнейшие клинические наблюде- 55 ния и лабораторное обследование во всех указанных случаях подтвердили точность предлагаемого способа.

У остальных 13 детей, у которых имелась желтуха в периоде новорожденкости, наличия ГБН как известным, так и предлагаемым способами не выявлено, у них имелась конъюгационная желтуха или желтуха вследствие рассасывания кровоизлияний.

Исследования крови 23 здоровых новорожденных как известным так и предлагаемым способами дали отрицательные результаты.

Предлагаемый способ позволяет выявить изоиммунологический конфликт ке только го системе антигенов резус и АВО, но и по другим, в том числе редким и малоизученным актигенам крови, диагностические сыворотки к которым отсутствуют или труднодоступны.

Способ обнаруживает само возникновение реакции антиген — антитело— комплемент. Это обеспечивает его высокую специфичность и точность при диагностике изоиммунологического конфликта у новорожденных. Кроме того, способ позволяет выявить ГБН в начальной стадии ее развития, на доклиническом уровне, сразу после рождения ребенка,.

Предлагаемый способ прост, доступен широкому кругу специалистов, реализуется он при использовании отечественных аппаратуры и реактивов. Способ требует малых временных (около

2 ч) и трудовых затрат.

Таким образом, изобретение обеспечивает точность и надежность способа диагностики ГБН.

Формула изобретения

ВНИИПИ Заказ 3958/42 Тираж 776 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4