Способ триэфирного синтеза олигонуклеотидов

 

Изобретение относится к химии нуклеиновых кислот, в частности к триэфирному синтезу олигонуклеотидов (ОНТ), которые применяются в биологии и генной инженерии. Цель - ускорение процесса. Синтез ОНТ ведут конденсацией 3-п-хлорфенш1фосфата захдищенного нуклеозида или ОНТ с защищенным нуклеозидом, нуклеотидом или олигонуклеотидом, содержащим свободную 5 -ОН группу в пиридине при действии конденсирующего агента (КА) и в присутствии катализатора (КТ). В качестве КТ используют 4-М,Н-диметш1аминопиридин-1-оксид, взятый в-3-кратном мольном избытке по отношению к КА. В качестве последнего используют 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид или 1-(2,4,6-триизопропипб ензолсульфонш1)-3-нитро-1,2,4-триазол. Способ обеспечивает повышение скорости конденсации примерно в 3 раза. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл. i О) ОО сд со со 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) 51938 А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3778793/23-04 (22) 10.08.84 (46) 15.11.87. Бюл. ¹ 42 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72),10,À. Горбунов и В.В. Самуков (53) 547.455.07(088.8) (56) Каюнин А.П., Берлин Я.А., Колосов М.И. Нуклеофильный катализ межнуклеотидной конденсации в фосфотриэфирном синтезе олигонуклеотидов.

Биоорганическая химия, 1982, т. 8(5) с. 660-666, Evimov В.А., Pezezdatto С.В..Cha-

shmacehieva О.Т. Hucleic acids reseach. New affect mithod for the Sen;—

thesis of oligonucleotides, 1982,v.10, ¹ 21, р. 6675-6694. цц С 07 Н 19/073 19/173 21 04 (54) СПОСОБ ТРИЭФИРНОГО СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ (57) Изобретение относится к химии нуклеиновых кислот, в частности к триэфирному синтезу олигонуклеотидов (ОНТ), которые применяются в биологии и генной инженерии. Цель — ускорение процесса. Синтез ОНТ ведут конденсацией 3-и-хлорфенилфосфата защищенно-. го нуклеозида или ОНТ с защищенным нуклеозидом, нуклеотидом,или олигонуклеотидом, содержащим свободную

5 -ОН группу в пиридине при действии конденсирующего агента (КА) и в присутствии катализатора (КТ). В качестве КТ используют 4-й,й-диметиламино- Я пиридин-1-оксид, взятый -3-кратном мольном избытке по отношению к КА.

В качестве последнегр используют

2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид или 1-(2,4,6-триизопропилбензолсульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазол. Способ обеспечивает повышение скорости кон- в денсации примерно в 3 раза. 1 s.n. Qg ф-лы, 1 ил., 2 табл. CA

1351938

Ммтг

ВЭЖХ

Изобретение относится к химии нуклеиновых кислот и представляет собой усовершенствованный способ, триэфирного синтеза олигонуклеотидов, находящих широкое применение в молекулярной биологии и генной инженерии.

Цель изобретения — ускорение процесса фосфотриэфирного синтеза олиго.ну1.леотидов за счет повышения скорос3 ти реакции конденсации путем применения в качестве катализатора. 4-N N-диметиламинопиридин-l-оксида.

Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретение, где используют следующие сокращения и условные обозначения:

dbzA -"N<-бензоил-2 -дезоксиаде" нозин;

dT — 2 -дезохситимидин;

dbzC - N -бензоил-2 †дезоксици — тидин;

dibG " И -изобутирил-2 -дезокси2 l гуанозин;

CE — 2-цианоэтил-;bz — 3 -О-бензоил-;

tbbz — 3 -0- (п-трет-бутилбензо— ил ) —;

+ — межнуклеотидная (3 -5 ) связь, блокированная п-хлорфенильной группой;

TPS — 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид;

ТР5"Т, — 1-(2,4,6-триизопропилбензолсульфонил)3-нитро-1,2,4триазол;

Helm -"М -метилимидазол;

ОМТг — 4,4 -диметокситрифенилметил; — 4-метокситрифенилметил; — высокоэффективная жидкостная хроматография;

11МАР— 4-N,11-диметиламинопиридин;

ДЖАРΠ— 4-N,N-диметиламинопиридин-2-оксид.

Пример 1. Сравнение скоростей конденсации в синтезе ОМТг-dbrA

dbzC-tbbz при использовании различных конденсирующих агентов.

К 2 мл раствора, содержащего

0,025 ммоль триэтиламмониевой соли

3-п-хлорфенилфосфата ЭИТг"dbzА„

0,0375 ммоль d bzC-tbbz, 0,225 ммоль катализатора (DMAPO> 0ИАР> Ие!л) или без катализатора, добавляют в атмосфере сухого аргона конденсирующий агент (TPS или TPSNT, О,1 ммоль) и выдерживают смесь при 20 С. Через определенные промежутки времени с по)p

35 ао а5

55 мощью шприца отбирают аликвоты по

4-5 мкл. Аликвоту наносят на пластинку Зх8 см со слоем сипикагеля (Pla t ikfol 1еп К1eselgel Р > "Herck"

ФРГ) и хроматографируот в системе хлороформ-этанол (9:1). Пятна с Р.g

0„1 (исходный фосфатный компонент) и Р 0,75 (продукт конденсации)> окрапивающиеся в оранжевый цвет парами трифторуксусной кислоты, раздельно снимают с пластинки и помещают в центрифужные пробирки, содержащие

10 мл смеси этанола и 707 хлорной кислоты (2:3 по объему) Пробирки интенсивно встряхивакт и содержимое центрифугируют. Измеряют спектрофоI тометрически концентрацию 4,4 -диметокситриэтилкатиона (E „„„ = 71,700, 498. HM) Вычисляют степень превращения 1 по формуле

0t и= вЂ, IOOZ

Dt ° D а где Dt — оптическая плотность экстракта из пятна продукта конденсации (Rg 0>75);

Dd — оптическая плотность экстрак та из пятна непрореагированного фосфатного компонента (Р < 0,1).

На чертеже приведены графики зависимости степени превращения >! от времени реакции.

Пример 2. Синтез динуклеотида DHTrd (Т+Т+СЕ) в присутствии 4М>N-диметиламинопиридин-1-оксида с применением производных арилсульфокислот как конденсир лощих агентов.

К раствору 102 мг (О,!2 ммоль) триэтиламмонийной соли DNTr dT+H

49 мг (0,1 ммоль)ОТ+1.E и 83 мг (0,6 ммоль) 0МАРО в l,5 мл безводного пиридина добавляют 0,3 ммоль производного арилсульфокислоты и выдерживают

3 мин. Прекращают реякцию добавлением льда и к реакционной смеси приливают 20 мл хлороформя. Органическую фазу промывают 2х20 ил 0,1 И раство— ра триэтиламмонийбикярбоната и высушивают безводным Йа . >О . Хлороформ упаривают в вакууме и остаток хроматографируют на колонке с силикагелем в градиенте концентрации этанола и хлороформе. Фракции, содержащие продукт конденсации, собирают, упаривают в вакууме. Определяют выход продукта после высаживания в гексан, вы1351938 4

15

50

Megm

DMAP

DMAP0

15,3

33 5

84,4

Пример 4. Получение тетра— нуклеотида MMTr-d(bzA+ibG+bzAa.CE).

К раствору 0,2 ммоль триэтиламмони1 евой соли 3 -п-хлорфенилфосфата

MMTr-d (bzA+ i bG+H} 0,2 ммоль 4 (i bGa. сушивают в вакуум-эксикаторе и взвешивания. .Выход динуклеотида DMTrd (Т Т СЕ) при синтезе в присутствии ДМАРО и раз- 5 личных конденсирующих агентов следующий,. Е:

2,4,6-Триизопропилбензолсульфохлорид (TPS-Cl) 90

Мезитиленсульфохлорид (MSCl) 64 и-Толуолсульфохлорид (ТКI ) 74

1 — (и-Толуолсульфонил) 3— нитро-1,2,4-триазол (TSNT) 84

1-(Мезитиленсульфонил)тетразол

1-(2,4,6-Триизопропилбензолсульфонил)-3-нитро20

1,2,4-триазол (TPS-NT) 93

Пример 3. Сравнение скорости межнуклеотидной конденсации на полимерном носителе в присутствии различных нуклеофильных катализато- 25 ров.

В качестве полимерного носителя используют целлюлозные диски хроматографической бумаги Whatman 3 MM на которых иммобилизован тимидин-3 - Зд

0 — сукцинат (12 мкмоль на диск или

390 мкмоль/г) а непрореагировавшие гидроксильные группы углеводных звеньев заблокированы ацетальными остатками.

Упаривают 0,06 ммоль (0.,0441 г)

DMTI T+H и 0,3 ммоль катализатора совместно с целлюлозным диском при добавлении сухого пиридина. Затем добавляют 2 мл сухого пиридина и при 40 перемешивании — 0,12 ммоль (0,0363 r)

TPS Через 3 мин каждый диск отмыва— ют пиридином и хлороформом и определяют количество присоединенного нуклеотида по поглощению диметокситри- 45 тилкатиона при 498 нм в растворе хлорная кислота — этанол (3:2) Результаты эксперимента:

Катализатор Процент включения нуклеотида

bzA+CE) 1,2 ммоль DMAPO в 2,5 мл безводного пиридина добавляют

0,5 ммоль TPS °

Через 3 мин реакционную смесь обрабатывают, как в примере 2, и осаждением эфиром получают 0,!92 ммоль (485 мг, 96X.) тетрануклеотида.

Пример 5. Синтез олигонуклеотида d(Т-С-С-A-G-G-Т) на целлюлозном носителе.

Целлюлозный диск бумаги Whatman

3 ММ с иммобилизованным тимидин-3 —

0-сукцинатом (5,3 мкмоль) и блокированными ацетилированием остаточными гидроксильными группами целлюлозы помещают в шприц вместимостью 5 мл и промывают безводным ацетонитрилом.

Затем в шприц набирают пиридиновый раствор, содержащий 20-кратный избыf ток 5 -0-диметокситритилнуклеозид3 -0-(4-хлорфенил)-фосфата, 20-кратный избыток TPSNT и 60 †кратн избы— ток DMAPO относительно иммобилизованного первого нуклеозидного звена и выдерживают 5 мин при комнатной температуре. Раствор активированного нуклеотида удаляют и после промывки диска растворителями в последовательности, указанной в табл. 1, проводят деблокирование 37.-ным раствором трихлоруксусной кислоты в хлороформе.

Далее осуществляют последовательность операций в соответствии с табл.2. После завершения последнего цикла наращивания олигонуклеотидной цепи иммобилизованный олигонуклеотид детритилируют раствором трихлоруксусной кислоты в хлороформе, целлюлозный диск промывают хлороформом и ацетонитрилом, извлекают из шприца и помещают в 10 мл 0,5 М раствора п-нитробензальдоксимата лития в водном пиридине.

Диск выдерживают в деблокирующем растворе 12 ч при комнатной температуре, после чего раствор отделяют фильтрованием и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл концентрирован ного водного аммиака и раствор нагревают в плотно закрытой колбе 24 ч при 40 С. Аммиак удаляют в вакууме, остаток нейтрализуют 50X — ной уксусной кислотой и разбавляют до 15 мл водой. Водную фазу экстрагируют этилацетатом, упаривают в вакууме и обессоливают пропусканием через колонку с био-гелем P-2. Продукт выделяют с помощью ионообменной ВЭЖХ в линейном градиенте калийфосфатного буфера

1351938 (pH 6 5) на сорбенте, изготовленном на основе аилохрома, модифицированном сшитым полиэтиленимином.

Выход, определенный после выделения олигонуклеотида ионообменной хроматографией, составил 34 (или 85 на каждую стадию конденсации).

Пример 6. Синтез олигонуклеотида d 4CAATTAACAATA). 10

Навеску полимерного носителя (0,049 г)на .основе CPG-250 5, на котором известным методом иммобилизовано первое нуклеозидное звено (удельная загрузка 80 мкмоль/г), по- 15 мещают в реактор колоночного типа, снабженный фильтрующими пластинками.

Через реактор пропускают З -ный раствор трихлоруксусной кислоты в хлороформе (0,5 мин) ° Затем проводят про- 20 мывку растворителями как указано в табл. 2.

Промывают реактор аргоном в тече— ние 1 мин и подают в него смесь нуклеотида (40 мкмоль), TPS и ОИАРО в молярном соотношении 1:2:6 в 1-1,5 мл абс.пиридина. Избыток.нуклеотида от/ носительно первого нуклеотидного звена, иммобилизованного на носителе, составляет 10 экв. 30

Реактор закрывают и встряхивают 5 мин. Далее операции проводят в соответствии с табл. 2. За степенью протекания межнуклеотидных конденсаций следят посредством измерения поглоще — 3 ния диметокситритилкатиона в элюате после деблокирования при 498 нм. Вы-ходы на каждой стадии превышают 90 .

После завершения последнего цикла наращивания олигонуклеотидной цепи 40 носитель помещают в 2 мл 0,5 М раствора п-нитробензальдоксимата лития в водном пиридине. Смесь выдерживают .в течение ночи при комнатной температуре, после удаления носителя растворитель упаривают в вакууме, остаток обрабатывают аммиаком и далее

1 очищают целевой продукт как описано в примере 5, Выход олягонуклеотида

d(СААТТААСААТА) составляет 99,3 ОЕ при 260 нм или 17 от теоретического.

Средний выход на стадию составляет

86%.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает боле» высокую скорость конденсации (примерно в 3 раза) чем способ-прототип,:<ак в твердофаз— ном варианте триэфирного синтеза оли— гонуклеотидов, так и:зри синтезе олигонуклеотидов в растворе. Достигаемые при этом выходы целевых продук— тов не ниже, чем при использовании способа-прототипа. В случае твердофаз ного метода синтеза r.ýêðàùåíèå време— ни конденсации позволяет значительно сократить общую длитепьность наращивания олигонуклеотиднэй цепи.

Формула и з о б р е т е н и я

1. Способ триэфирного синтеза олигонуклеотидов конденсацией 3-п-хлорфенилфосфата защищенного нуклеозида или олигонуклеотида с защищенным нуклеозидом, нуклеотидом или олигонуклеотидом, содержащим свободную 5 -гидроксильную группу, в пиридине при действии производного арилсульфоксилоты в качестве конденсирующего агента и в присутствии катализатора, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения процесса, в качестве катализатора используют 4-N-И-димитиламминопиридин-1 — оксид, взятый в 2 — 3— кратном молярном избытке по отношению к конденсирующему агенту.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— щ.и и с я тем, что z качестве кон— денсирующего агента vспользуют 2,4, 6-триизопропилбензолсульфохлорид или

1-(2,4,6-триизопропилбензолсульфонил) — 3 — нитро — 1,2,4-триазол.

1351938

Таблица 1

Карта операций для одного цикла наращивания олигонуклеотидной цепи на целлюлозном носителе

Операция Растворители и реагенты Время, мин

Промывка Ацетонитрил

Конденсация

Промывка

Промывка Ацетоннтрил

Промывка Хлороформ

Детритилирование 3Х-ный р-р CCI СООН в хлороформе

Промывка

Хлороформ

Таблица 2

Карта операций одного цикла наращивания олигонуклеотидной цепи на носителе CPG 250 А

Операция

Растворители и реагенты

37.-ный р-р СС1 СООН в хлороформе

Деблокирование

0,5

0 5

0,5

0,5

0,5

0,5

Промывка

Промывка

Ацетонитрил

Хлороформ

Промывка

Промывка

Промывка

Промывка

Высушивание

Конденсация

I 1

20-кратный избыток 5 — 0-диметокситритилнуклеотида, TPSNT и ОЙАРО в соотношении 1:1:3) в абс.пиридине

Пиридин

Хлороформ

Ацетонитрил

Ацетон

Гексан

Аргон

5 -О-диметокситритилнуклеотид, I

7PSr 0ИАРО (1:2:6) в абс.пиридине

1351938

Составитель Г.Коннова

Редактор Н.Киштулинец Техред H.Bepec Корректор О. Кравцова

Заказ 6424

ПроизводстВенно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Ъ

Ф1

+)

7И

_#_ b

Ь

И

Ь 4и

Ф

1 ,ф Л7

N Ю 0 Sd УУ

Ю В я н л (I минушох) Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5