Способ очистки @ -глюканазы

 

Изобретение относится к биотехнологии . Цель изобретения - ускорение процесса очистки и повышение выхода целевого продукта. Способ предусматривает растворение ферментного препарата / -глюканазы в воде, содержащей 10 М CaCl, обессоливание гель-фильтрацией на сефадексе G-25 со скоростью гель-фильтрации 0,4-0,5 мл/см мин, в полученный раствор добавляют цистеин или глютатион в количестве 0,03-0,08 мг на ед. активности р-глюканазы, после чего проводят очистку хроматографией на карбоксиметилцеллюлозе и концентрируют элюат методом ультрафильтрации. Удельная активность фермента повышается в 6-7 раз. Выход 1,6-1,9 раз. 1 табл., 1 ил. с S (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51) 4 С 12 N. 38

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3961575/28-13 (22) 01. 10. 85 (46) 23. 11.87. Бюл. У 43 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) Т.Я.Рафаловская, Э.А.Шишкова .и Л.И.Орещенко (53) 577. 15 (088.8) (56) Фирантене P.Ê., Авиженес В.Ю. и др, Очистка и некоторые свойства

Р -глюканаэы иэ Bacillus subtilis.—

Биохимия, 1981, т. 46, У 4, с. 603611.

Заявка Японии И 53-12995, кл. С 12 N 9/38, опублик. 1978 ° (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ Р -ГЛЮКАНАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения — ускорение процесса очистки и повышение выхода целевого продукта. Способ предусматривает растворение ферментного препарата Р -глюканазы в воде, -1 содержащей 10 M СаС1., обессоливание гель-фильтрацией на сефадексе

С-25 со скоростью гель-фильтрации

0,4-0,5 мл/см мин, в полученный раствор добавляют цистеин или глютатион в количестве 0,03-0,08 мг на ед. активности -глюканазы, после чего проводят очистку хроматографией на карбоксиметилцеллюлозе и концентрируют элюат методом ультрафильтрации.

Удельная активность фермента повышается в 6-7 раз ° Выход 1,6-1,9 раэ.

1 табл., I ил.

1 1353807 2

Изобретение относится к биотехнологии, н частности к ферментной отрасли микробиологической промышленности, и может быть использовано в

5 производстве очищенной 1,3-1,4- P —-глюканаэы, свободной от примеси сопутствующих ферментов и других балластных веществ, фермент может использоваться в аналитических целях 0 для изучения структуры глюканон.

Цель изобретения — ускорение процесса очистки и повышение ныхода целевого продукта.

На чертеже приведены зависимости влияния концентрации СаС1 на степень оснетления ферментного ра.створа и потери Р --глюконазы при фильтрации, где 1 — степень осветления фильтрата по сравнению с исходным раствором;

2 — потери фермента с балластным осадком.

Способ заключается н том, что на стадии приготовления ферментного

Ю раствора к используемой для его раст- 25 ворения воде добавляют 10 M СаС1г.

При данной концентрации СаС1г удается добиться максимального осветления препарата за счет отделения балластных белков при минимальной потере целевого продукта. Замена диализа гельфильтрацией на сефадексе G-25 г при скорости элюции 0,4-0 5 м/см мин позволяет ускорить очистку и увеличить выход фермента, Увеличение выхода фермента достигается также введением в ферментный раствор (перед хроматографией) цистеина или глутатиона в количестве 0,03-0,08 мг на единицу активности Р --глюканазы, 40

Отсутствие данных о роли сульфогидрильных групп н Р -глюканазе свидетельствует с неочевидности действия цистеина и глутатиона на выход фермента. Применение указанной сонокуп- 45 ности признаков позволяет ускорить процесс очистки на 24-45 ч и увеличить выход от 19,4 до 32,8%.

Пример 1. Для получение высокоочищенного препарата Р --глюканазы

50 г протосубтилин Г10х с глюканазной активностью 250 ед/г и содержанием белка 110 мг/г растворяют в

500 мл дистиллированной воды, содер- жащей 10 М СаС1г . Нерастнориншийся осадок отделяют центрифугиронанием, Прозрачный ферментный раствор, содержащий нейтральную протеиназу, Р -глюканазу и < -амилазу активностью

Р -глюканаэы 23,3 ед/мп и содержанием белка 10,2 мг/мл направляют на обессоливание. С этой целью используют гель-фильтрацию на сефадексе С-25, загруженном н колонку размером

50х8О0 мм.. Сефадекс уравновешивают

10 М фосфатным буфером рН 7,0, содержащим 0,005 М СаС1 . На колонку наносят 500 мл ферментного раствора со скоростью 0,4 мп/мин см и после гель-фильтрации получают обессоленную фракцию объемом 2000 мл, содержащую 4,6 ед/мл Р -глюканазы и 2 мг/мл белка. Полученный ферментный раствор поступает на ионообменную хроматографию, которая проводится на карбоксиметилцеллюлозе (КМ-целлюлозе), загруженной в колонку размером 140х140 мм.

-г

Ионнообменник уравновешивают 10 М фосфатным буфером рН 7,0. Пля улучшения очистки и повышения выхода -глюканазы на стадии ионообменной хроматографии н обессоленный ферментный раствор вводится цистеин в расчете 0,03 мг на единицу .активности фермента. После нанесения обессоленного ферментного раствора колонку промывают 3 л исходного буфера для полного удаления с KM-целлюлозы М -амилазы, Затем колонку промывают 2,5 л исход-г ного буфера, содержащего 7 10 М

NaC1. При этом происходит элюация протеолитической фракции, Затем пронодят злюцию Р -глюканазы исходным буфером, содержащим 1М МаС1, н результате последней элюции получают

800 мл раствора активностью -глюканазы 7 ед/мл и содержанием белка

0,5 мг/мло В. указанной фракции не обнаружено протеолитической и амилолитической активности ° Концентрирование элюата Р -глюканазы проводят методом ультрафильтрации через ацетатцеллюлозные мембраны типа УАМ-100 при рН раствора 7,0.В результате получают фракцию объемом 40 мл содержанием (-глюканазы 111 ед/мп и белка 7,4 мг/мл. Выход по активности по сравнению с исходным препаратом

35,57. Удельная активность фермента повышена н 6,5 раза. После лиофилиэации получен высокоочищенный препарат Р -глюканазы.

Выход фермента на стадиях очистки приведен в таблице.

По сравнению с известным способом выход (5 -глюканазы увеличен в 1,8 раза (таблица).

1353807

Пример 2. Способ получения высокоочищенного препарата (3 -глюканазы из протосубтилина Г10х аналогичен способу, описанному в примере 1, 5 до стадии ионообменной хроматографии на KM-целлюлозе. В данном случае перед нанесением на колонку с ионообменником в обессоленный ферментный раствор вносят глютатион из расчета 10

0,07 мг на единицу активности 8 -глюканазы. Для элюции . of -амилазы, протеиназы и -глюканазы используют те же растворы, что и в примере 1, Фракция (--глюканазы объемом 850 мл 15 имеет активность 7 ед/мл и содержание белка 0„4 мг/мл. В полученном растворе отсутствуют протеиназа и

-амилаза. Концентрирование элюата

-глюканаэы проводят в условиях, 20 описанных в примере 1. Концентрат объемом 25 мл содержит 190 ед/мл

-глюканазы и 12,3 мг/мл белка, Выход по активности по сравнению с исходным препаратом 38, удельная активность повышена в 6,7 раза. Далее концентрат высушивают лиофильно или осаждают глюканазу ацетоном. По сравнению с известным способом выход -глюканазы увеличен в 1,9 раза, а 30 степень очистки фермента увеличена на 6,3 ..

Пример 3. Способ получения высокоочищенного препарата Р -глюканазы из протосубтилина Г10x аналогичен способу, описанному в примере i до стадии гель-фильтрации на сефадексе С-25. Колонку с сефадексом уравновешивают 2 10 М ацетатным буфером рН 6,2, содержащим 0,005 M СаС1 .

На колонку наносят 500 мл ферментного раствора активностью Р -глюканазы

23,3 ед/мл и содержанием белка

10,2 мг/мл, скорость гель-фильтрации

0,5 мл/мин-см . После гель-фильтрации 45 получают 1800 мл обессоленного раствора активностью Р -глюканазы 5 ед/мл и содержанием белка 2 мг/мл. В этот раствор добавляют цистеин в количестве 0 05 мг на единицу активности

Р -глюканазы и наносят на колонку с

-2

KM-целлюлозой, уравновешенной 2.10 М ацетатным буфером при рН 6,2. Далее колонку промывают 3,5 л исходного буфера для элюции of, -амилазы. После этого проводят, элюцию нейтральной протеиназы, пропуская через колонку

3 л исходного буфера, содержащего

15 10 M NaCl. Злюцию Р-глюканазы проводят исходным буфером, содержащим 0,8 M МаС1. В результате получают

900 мл раствора активностью P ""глюканазы 5,5 ед/мл и содержанием белка

0,4 мг/мл. В укаэанной фракции отсутствуют протеиназы и М -амилаза. Концентрирование элюата Р - глюканазы проводят методом ультрафильтрации через ацетатцеллюлозные мембраны

УАМ-100 при рН раствора 6;2. Концентрат фермента объемом 25 мл имеет

Р -глюканазную активность 160 ед/мл и содержание белка 10,9 мг/мл. Выход по активности по сравнению с исходным препаратом 32 . Удельная активность фермента повышается в 6,4 раза.

Далее концентрат высушивают лиофильно или выделяют Р -глюканазу ацетоном. По сравнению с известным способом выход P -ãëþêàíaçû увеличен в

1,6 раза, а процесс очистки сокращен на 45 ч.

Пример 4. Для получения высокоочищенного препарата Р -глюканазы

800 г протосубтилин Г10х глюканазной активностью 400 ед/г и содержанием белка 120 мг/г растворяют в 8,0 л дилстиллированной воды, содержащей

-2

10 М CaC12. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием. Прозрачный ферментный раствор активностью

Р -глюканазы 37 ед/мл и содержащем белка 11,2 мг/мл направляют на обессоливание методом гель- фильтрации на сефадексе G-25. загруженном в колонку размером 200х630 мм. Условия обессоливания аналогичны описанным в примере 1. Скорость фильтрации

0,47 мл/см "мин, После гель-фильтрай„ ции получают фракцию объемом 20,0 л, содержащую 11,2 ед/мл 8-глюканазы и

3,3 мг/мл белка. В обессоленный ферментный раствор вносят глютатион в количестве 0,05 мг на единицу активности Р -глюканазы и напр вляют на колонку размером 110х160 см, загруженную КМ-целлюлозой для проведения ионообменной хроматографии. Полное удаление ь . -амилазы с КМ-целлюлозы происходит в результате промывания колонки 20 л исходного буфера. Затем колонку промывают 10 л исходного буфера содержащего 7 10 M NaCl для элюции протеиназы. В результате элюции исходным буфером, содержащим

iM NaCl, получают 6,0 л раствора активностью P -ãëþêàíàçû 22 ед/мл и содержанием белка 3,3 мг/мл. Проте1353807 инаэа и Ы -амилаза отсутствуют в этой фракции. После концентрирования полученного элюата методом ультрафильтрации через мембраны типа

УАМ-100 при рН раствора 7,0 получают концентрат объемом 200 мл, активностью Р --глюканазы 530 ед/мл и содержанием белка 24,3 мг/мл. Выход фермента по сравнению с исходным 10 . препаратом 33, 1%. Удельная активность фермента повышается в 6,6 раза.

После лиофилизации или осаждения ацетоном получают высокоочищенный препарат -глюканазы. Сокращают 15 процесс на 42 ч.

Пример 5. Способ получения высокоочищенного препарата Р -глюканазы из протосубтилина Г10х аналогичен способу, описанному в примере l, 20 до стадии ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе. Перед этой стадией обессоленный ферментный раствор вносят глютатион в количестве 0,08 мг на единицу активности -глюканазы.. 25

Элюция . В -глюканаэы проводится в тех же условиях, которые описаны в примере 1. Фракция Р -глюканаэы объемом 320 мп имеет активность 7,3 ед/мл и содержанием белка 0,4 мг/мл. В по- 30 лученном элюате отсутствуют протеиназа и М, -амилаза. Концентрирование фракции -глюканазы проводят в условиях, описанных в примере 1. Концентрат объемом 30 мл содержит 160,5 ед/мл З5

-глюканазы и 194 мг/мл белка. Выход по активности по сравнению с исходным препаратом 38,5%, удельная активность повышена в 6,8 раза. Далее концентрат высушивают лиофильно или 40 глюканазу осаждают ацетоном. По сравнению с известным способом выход глюканазы увеличен в 1 98 раза.

На стадии приготовления ферментного раствора для коагуляции балластных белков целесообразно вносить

-2

СаС12 в концентрации 10 M. Эта концентрация оптимальна, так как обеспечивает получение фильтрата ферментного раствора необходимого качества при сравнительно небольших потерях

-глюканазы с, балластным осадком (чертеж).

Увеличение скорости элюции с сефадекса С-25 до 0 6 мл/см мин или

t

2 уменьшение до 0,3 мл/см мин приводит к значительному увеличению объема элюата, содержащего Р -глюканазу, т.е. к разведению ферментного препарата.

Пример 6. Р -глюканазу выделяют как описано в примере 1, но вместо протосубтилина I 10x в качестве исходного препарата используют осадок, полученный из культуральной жидкости осаждением этанолом. Выход фермента (от стадии культуральной жидкости)33%.

Формула из обретения

Способ очистки Р --глюканаэы, включающий растворение исходного ферментного препарата в воде, его обессоливание, хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе и концентрирование, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения процесса очистки и повышения выхода целевого продукта, ферментный препарат растворяют в воде, -2 содержащей 10 M СаС1.2, обессоливание проводят гель-фильтрацией на сефадексе Г-25 со скоростью 0 4

1

0,5 мл/см мин, а перед хроматографией в ферментный раствор добавляют цистеин или глютатион в количестве

0,03-0,08 мг на единицу активности

Р --глюканазы.

1353807

Выход фермента, Ж к исходному продукту

Выход фермента на стадии очистки 7

Стадии очистки без стабилизабез стабилизатора в присутствии в присутствии цистеи- глютана тиона цистеи- глютатиотора на на,Протосубтилин

Г10х

100

100

92-93

92-93

76-79

70-73

Ионообменная . хроматография

44-45 55-60 59-65

32-33 40-45 4 1-47

Ультрафильтрация

26 32-35 33-38

79

Crnenerrb ОсФаамежгм

Р,И5 ОИ7 РИ 0Z

Составитель В.Муронец Техред Л.Олийнык Корректор С.Шекмар

Редактор Н.Рогулич

Заказ 5670/24 Тираж 500- Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Э

Производ твенно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул. Проектная, 4

Приготовление ферментного раствора

Гель-фильтрация на сефадексе

С-25

005 анц.

СаС1, Ф