Способ получения двух молекулярных форм карбоангидразы

 

Изобретение относится к технике производства очищенных ферментных препаратов. Цель изобретения - повышение выхода, а также упрощение и ускорение процесса. Способ заключается в том, что для получения экстракта , обладающего карбоангидразной активностью, из гомогенизированных листьев бобов гомогенат подкисляют до рН 6,0-6,5 с последующим растворением белков, осажденных сульфатом аммония, в цитратно-фосфатном буфере с рН 4,5-5,5, проведением гель-фильтрации на сефарозе 6Б при рН 6,5-7,0, разделением и очисткой форм 1 и 2 карбоангидразы методом ионо-обменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, при этом колонку промывают триссульфатным буфером с рН 8,0-8,5, содержащим 20-40 мМ сульфата натрия, затем элюируют последовательно карбоангидразу 1 и карбоангидразу 2 триссульфатным буфером , содержащим сначала 60-70 мМ, затем 40-50 мМ сульфата натрия с рН 8,0-8,5 и 5,5-6,5 соответственно. Способ позволяет получить две высокоочищенные формы карбоангидразы, повысить в 2 раза их активность, увеличить в 4 раза выход целевых продуктов и обеспечить высокую стабильность ферментов при хранении. 1 табл. 4 ил. ( сл w сд ;о ю со оо

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51j 4 С 12 N 9/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A BTGPCHGIVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4092390/31-13 (22) 14.07.86 (46) 15.!2.87. Бюл. ¹-. 46 (71) Институт биохимии им.А.H.Баха (72) 10.Yi.Комарова и Н.Г.Доман (53) 577.15 (088.8) (56) Kachry R.В., Anderson Z.Е.Р1anta, 1974, V. 118, № 33, р.235-240.

Комарова !О.М., Доман Н.Г., Шапош— ников Г.Л. Биохимия, 1982, т.47, № 6, с.,1027 †10. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУХ МОЛЕКУ—

ЛЯРНЫХ ФОРМ КАРБОАНГИДРАЗЫ (») Изобретение относится к технике производства очищенных ферментных пре:араратов. Цель изобретения — повы— шение выхода, а также упрощение и ускорение процесса. Способ заключается в том, что для получения экстракта, обладающего карбоангидраз— ной активностью, из гомогенизированных листьев бобов гомогенат подкисляют до рН 6,0-6,5 с последующим (19) (11)

А1 растворением белков, осажденных сульфатом аммония, в цитратно-фосфатном буфере с рН 4,5-5,5, проведением гель-фильтрации на сефарозе

6В при рН 6,5-7,0, разделением и очисткой форм 1 и 2 карбоангидразы методом ноно-обменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, при этом колонку промывают триссульфатным буфером с рН 8,0-8,5, содержащим 20-40 мМ сульфата натрия, затем элюируют последовательно карбоангидразу 1 и карбоангидразу 2 триссульфатным бу— фером, содержащим сначала 60 — 70 мМ, затем 40 — 50 мМ сульфата натрия с рН 8,0 — 8,5 и 5,5 — 6,5 соответственно.

Способ позволяет получить две высокоочищенные формы карбоангидразы, повысить в 2 раза их активность, увеличить в 4 раза выход целевых продуктов и обеспечить высокую стабильность ферментов при хранении.

1 табл. 4 ил.

1359298

Изобретение относится к биохимии, а именно к технике производства очищенных ферментных препаратов из растений, в частности к получению карбоангидразы, и может быть использовано в научных исследованиях различных направлений биохимии, биотехнологии, генетики, а также в медицине для фи-;иологических исследований.

Карбоангидраза (КФ 4.2.1.1, карбонатгидролиаза — КА) представляет собой фермент, катализирующий обратимую реакцию гидратации двуокиси углерода. Этот фермент широко распространен в растительном мире и имеет значение для самых разнообразных процессов жизнедеятельности клетки. Карбоангидраза — высокочувствительный фермент, остро реагирующий на дефицит цинка при минеральном питании растений„ животных и человека и используется как диагностический тест болезней, связанных с цинковой недостаточностью.

Цель изобретения — повышение выхода, активности и стабильности при хранении целевых продуктов„ упрощение и ускорение процесса, Спосоо осуществляют следующим об— разом.

Б качестве источника сырья используют литья бобов сорта "Черные русские, обладающие повышенным содержанием КА (87. от общего белка листьев бобов) .

После осуществления гомогенизации листьев бобов производят подкисление гомогспата путем прибавления 0,1 н.

Н 50,, по каплям рн 6,0 — 6,5 с последующим его центрифугированисм для получе ия суперпатанта-экстракта, обладающего IQ, †активност, и отделсния от осажденных балластных белков .

Зто позволяет полнее извлечь целевые продукты, лучше отделить их от примесных белков. Подкисление гомогената до pI- меньше 6 приводит к уменьшению количества. балластного белка в супернатанте, однако при этом наблюдается значительная инактивация обеих форм КА, особенно формы 1. При увеличении рН более 6,5 увеличивается количество примесного белка, лев решедшего в экстракт (при рН 8,0 белка в экстракте в 2 раза больше, чем при рН 6,0i, что снижает качество последующего от.",еления форм 1 и 2 от этого белка.

Белки экстракта, обладающие КА †активностью, высаливают сернокислым аммонием в узком интервале концентраций (40 †5). Осадок белков, полученный при 402-ном насыщении, не имеющий КА-активности, отбрасывают. Собирают осадок белков, полученный при

557.-ном насыщении сульфатом аммония.

При расширении интервала фракционирования до 30-60Х происходит сильное загрязнение КА-фракции примесным белком.

Осадок белков, полученный высаливанием сернокислым аммонием и содержащий карбоангидразу, перед проведением гель-фильтрации растворяют в минимальном обьеме цитратно-фосфатного буфера с рН 4,5-5,5. Карбоангидраза переходит в супернатант при последующем центрифугировании (20000g, 20 мин), а нерастворившийся белок, не обладающий КА-активностью, отбрасывают. При увеличении значения рН из осадка в раствор переходит большее количество примесного белка, что существенно ухудшает эффективность выделения и очистки КА на этой стадии. При уменьшении значения рН происходит резкое снижение выхода КА в растворимую фракцию.

Гель-фильтрацию проводят на колонке размером 2,5 70 см, заполненную сефарозой 6В; белки элюируют фосфатным буфером с рН 6,5 — 7,0.

Такое проведение гель-фильтрации увеличивает скорость элюации и ускоряет процесс выделения форм 1 и 2 на этой стадии по сравнению с прототипом в 2 раза. Указанные значения рН буфера являются оптимальными, поскольку обеспечивают стабильное состояние обоих форм КА при проведении гель-фильтрации. Уменьшение или увеличение зна ения pI приводит к соответствующему- снижению стабильности формы 1 либо формы 2 КА в растворе, вплоть до полного исчезновения активности за время осущест— вления гель †фильтрац (5 ч), и к готере этих ферментов в ходе после— дующего выделения и очистки другими методами.

Полученную после гель-фильтрации карбоангидразную фракцию подвергают ионообменной хроматографии на ДЕАЕ— целлюлозе, которую проводят на колонке размером 3 16 см, обеспечиваю—

1359298!

5 щей хорошую скорость элюации и позволяющей весь процесс разделения форм КА провести за 4 — 5 ч вместо

72 ч, необходимых для проведения

5 изоэлектрического фокусирования, т.е. уменьшающей временные затраты на осуществление этой стадии. Использование 0,01 М триссульфатного буфе— ра рН 8,0-8,5, содержащего 20 мм сульфата натрия в качестве уравновешивающего буфера, обеспечивает опти— мальную сорбцию исходной КА и полное связывание с ДЕАŠ†целлюлоз. При последующем промывании ДЕАЕ-целлюлозы указанным буфером КА-активность в элюате не обнаруживается. Использование рН уравновешивающего буфера ниже значений 8,0 ведет к неполной адсорбции форм 1 и 2 КА на ДЕАŠ†ц- 20 люлозе, к частичной десорбции КА и обнаружению ее активности в элюате.

При значениях рН выше 8,5 КА-актив— ность в элюате не обнаруживается, формы 1 и 2 связываются ДЕАЕ-целлю- 25 лозой полностью, однако промывание этими растворами инактивирует форму 2.

Картину элюирования форм 1 и 2

КА, помимо рН, определяет также ион- 30 ная сила буфера, которая создается добавлением сульфата натрия в буфер— ный раствор. При значениях рН буфера

8,0 — 8,5 и концентрациях сульфата натрия 60-70 мМ с ДЕАЕ-целлюлозы

35 элюируется только форма 1. При концентрациях сульфата натрия в буфере с рН 8,0-8,5, меньших оО-70 мМ, КА-активность в элюате не обнаруживается, а tlpH больших концентрациях наблюдается частичная инактизация форм 1 и 2. Получение формы 2 в этих условиях нежелательно вследствие ее сильной инактиацли в растворе с рН

8,,0-8,5. Оптимальную десорбцию формь| 2 с ДЕАЕ-целлюлозы осуществляют

0,01 М питратно-фосфатным буфером, .рН 5,5-6,5, содержащим 40-50 мМ сульфата натрия. Перед снятием формы 2 этим раствором колонку с

ДЕАЕ-целлюлозой тщательно освобождают от формы 1 и постороннего белка вначале вышеуказанным промыванием

0,0! М триссульфатным буфером, рН 8,0-8,5, содержащим 60-70 мМ сульфата натрия (500 мл), затем раствором 0,01 М цитратно — фосфатного буфера, рН 4,5 — 5,5 (500 мл), содер— жащ.|м 40-50 мМ сульфата натрия. Во всех случаях промывание колонки продолжают до полного исчезновения белка в элюате, что контролирует по измерению поглощения при 280 нм.

П р и и е р !. Объектом служат листья бобов сорта "Черные русские".

Растения выращивают в деревянных ящиках с почвой.

Стадия 1. 300 г свежеотобранных листьев (28-дневных) фиксируют жидким азотом и растирают в фарфоровой ступке с 300 мл 0,1 М триссульфатногс буфера, рН 7,8, содержащего

0,1 М МЭ и 0,002 ЭДТА. Растертую массу медленно размораживают путем нас стаивания при 4 С в течение 5 ч при гериодическом перемешивании. Полученный гомогепат при непрерывном перемешивании подкисляют до рН 6,3 прибавлением по каплям 0,1 í H

22000 g в течение 20 мин. Недостаточная жидкость содержащая 1380 мг бел— ка, — экстракт листьев.

Стадия 2. В экстракт добавляют твердый сульфат аммония до 40Х-ного насыщения. Осадок белков, полученный при этом насыщении, отделяют центрифурированием при 10000 д, 20 мин и отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 557.-ного насыщения. Осадок, обладающий КА-активностью, собирают центрифугированием (10000g, 20 мин) и растворяют в минимальном объеме (5-10 мл) 0,01 М цитратно-фосфа ного буфера, рН 5,0, содержашего 0,05 М МЭ, при перемешивании. Нерастворившийся белок, не обладаюший КА-активностью, отделяют центрифугированием при 20000п, 20 мин.

Стадия 3. Полученный супернатант наносят на стеклянную хроматографи— ческую колонку (размером 2,5 70 см), заполненную сефарсзой 6В, уравновешенную фосфатным буфером, рН 6,8, ссдержашим 0,05 II МЭ. После выхода

100 мл пустого объема сбор фракций пс 5 мл осуществляют на коллекторе фракций со скоростью 2 мл/мин.

Типичная картина гель-фильтрации на сефарозе 6В показана на фиг.1.

Во фракциях промеряют белок по поглощению при 280 нм и активность

КА колсриметрическим методом. Наиболее активные фракции с объемами вы1359298 хода 120 210 мл объединяют; полученный объем составляет 90 мл.

Стадия 4. Ферментный раствор наслаивают на колонку (размером

3-16 см) с ДЕАЕ-целлюлозой (номинальная емкость 0,60-0,80 мэкв/г, фактор набухаемости 9,0 мл/г сухого анионита, фирма "Реанал", Венгрия), уравновешенную 0,01 М триссульфатным 10 буфером, рН 8,2, содержащим 0,05 M

N3 и 20 мМ сульфата натрия (200 мл).

Неадсорбированный белок вымывают тем же раствором, получая элюат, не обладающий КА-активностью, который 15 отбрасывают. Фракционирование белков с ДЕАЕ-целлюлозы проводят в 2 этапа.

Первоначально колонку промывают растворами 40 мМ для промывки (200 мл, фракция 1) и 60 мМ (фракция 11, 20

200 мл) сульфата натрия в 0,01 M триссульфатном буфере, рН 8,2. Затем белки с ДЕАЕ-целлюлозы элюируют растворами 20 мМ для промывки (200 мл, фракция 111) и 40 мМ 200 мл, фрак- 25 ция 1У) сульфата натрия в 0,01 M цитратно-фосфатном буфере, рН 5,8.

Промывание растворами во всех случаях продолжают до полного исчезновения поглощения белка в элюате при 280 нм. 30

Фракции 1 и 111, не обладающие КАактивностью, отбрасывают. Активность

КА обнаруживается во фракциях 11 и 1У.

Сбор фракций !О мл осуществляют на коллекторе фракций со скоростью

10 мл/мин.

Фиг,2 отражает типичную картину элюации.

Во фракциях промеряют белок по поглощению при 280 нм и активность 40

КА. Наиболее активные фракции с объемами выхода 50-150 мл объединяют,.

Первая активная фракция 11 соответствует форме 1, содержит

94 мг белка и имеет удельную 45 активность 20500 Е/мг белка. Вторая активная фракция 1 является формой 2, содержит 12 мг белка и имеет удельную активность

9700 Е/мг белка.

Стадия 5. Полученные ферментные растворы форм 1 и 2 КА раздельно концентрируют сульфатом аммония при 70Х-ном насыщении, центрифугируют при 22000g, 20 мин и хранят в виде осадков под сульфатом аммония о при — 20 С. Активность формы 1 сохраняется в течение 6 мес без изменения, а формы 2 — 1 мес в этих условиях.

Полученные препараты форм 1 и 2 гомогенны: при исследовании в аналитической центрифуге Spinco, модель

Е (США), каждый фермент показывает единственный пик (Фиг.3) с коэффициентами седиментации 15,8 S и 16,0 S соответственно для форм 1 и 2 (скорость вращения ротора 48660 об/мин, съемка сделана после 16 мин достиже- ния равновесия при концентрации белка 3,5 мг/мл). При аналитическом диск-электрофорезе в 7,5 полиакриламидном геле каждая форма мигрирует в виде одной белковой полосы (фиг.4).

Результаты очистки и выделения форм 1 и 2 КА из листьев бобов приведены в таблице, где для сравнения даны также результаты очистки по известному способу.

Результаты, приведенные в таблице, показывают, что предлагаемый способ по сравнению с известным позво— ляет повысить активность гомогенных форм 1 и 2 КА в 2 раза и выход в 4 раза (в от общего белка листьев).

Пример 2. Способ осуществляют как в примере 1. После гомогенизации листьев бобов гомогенат подкисляют до рН 6,5, центрифугируют.

Экстракт, содержащий 1600 мг белка с удельной активностью 585 Б/мг белка, высаливают сульфатом аммония в интервале 40-55Х и садок растворяют в 5 мл

0,01 M цитратно-фосфатного буфера, рН 5„5. Полученный супернатант с удельной активностью КА 800 Е/мг белка, содержащий 350 мг белка, подверrают rель — фильтрации на сефарозе

6В 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,0.

КА-фракцию, имеющую удельную активность 4000 Е/мг белка (180 мг белка), хроматографируют на ДЕАЕ-целлюлозе, элюируя вначале форму 1 растворами

30 мМ (для промывки) и 70 мМ сульфата натрия в 0,01 М триссульфатном буфере, рН 8,5, затем форму 2— растворами 30 мМ и 50 мМ сульфата натрия в 0,01 М цитратно-фосфатном буфере, рН 6,5. Формы 1 и 2 получают гомогенными с выходом 7 и 0,6Х, степенью очистки 22 и 10, g, удельной активностью 22000 и "9500 Е/мг белка соответственно. Показатели также значительно выше, чем по известному способу, 1359298

Известныи способ

Получение экстракта из листьев бобов

100

1,0

246

2800

Фракционирование сульфатом аммония

3,0

981

933

Пример 3. Способ осуществляют как в примере 1. Однако гомогенат подкисляют до РН 6,0, осадок белков, высаливаемых сульфатом аммония, растворяют в 0,01 M цитратно-фосфатном буфере с РН 4,5, гельфильтрацию на сефарозе 6В проводят при РН 6,5. Последующее разделение форм 1 и 2 КА методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе ведут растворами 20 мМ (для промывки) и 60 мМ сульфата натрия в 0,01 M триссульфатном буфере, РН 8,0 и раствором 40 мМ сульфата натрия в

0,01 М цитратно-фосфатном буфере, РН 5,5. Формы 1 и 2 КА выделяются по этому способу с показателями (удельной активностью, выходу, гомогенности, степени очистки, стабильности), аналогичными примеРу

Таким образом, использование предлагаемого способа получения форм 1 и 2 карбоангидразы из растений упрощает технологию получения целевых продуктов и ускоряет процесс выделения ферментов в 15 раз за счет применения ионообмен.1ой хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе вместо изоэлектрического фокусирования, позволяет получить высокоочищенные ферменты за счет подбора оптимальных условий выделения и очистки карбоангидразы на стадиях гомогенизации, гельфильтрации, ионообменной хроматографии, повысить их активность в 2 раза, выход в 4 раза и стабильность при хранении.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения двух молекулярных форм карбоангидразы, предусматривающий гомогенизацию наземной

1ð части растений в буферном растворе, отделение твердой фазы из гомогената, осаждение белков из полученного экстракта сульфатом аммония при насыщении 40-557., растворение осадка и его гель-фильтрацию с последующим разделением двух форм фарбоангидразы, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода, активности и стабильности при хранении целевых продуктов, упрощения и ускорения процесса, гомогенат подкисляют до рН 6,0-6,5, растворение осадка осуществляют цитратно-фосфатным буфером с РН

25 4,5-5,5, гель-фильтрацию проводят на сефарозе 63 фосфатным буфером с

РН 6,5-7,0 с последующим разделением и очисткой целевых продуктов ионообменной хроматографией на колонке с

30 ДЕАЕ-целлюлозой, при этом колонку промывают триссульфатным буфером с

РН 8,0 — 8,5, содержащим 20-40 мМ сульфата натрия, затем элюируют карбоангидразу 1 и карбоангидразу П триссульфатным буфером, содержащим сначала 60 — 70 мМ, затем 40-50 мМ сульфата натрия с РН 8,0-8,5 и 5,56,5 соответственно.

1359298

8,1

17,5

4300

250

1,4

11000 44,8

40 фракция с формой 2

0,2

5000 20,3

Предлагаемый способ

Получение экстракта из листьев бобов 1380 450

100

l,0

Фракционирование сульфатом аммония 306

22,2

1,7

784

3496

10,1

7,7

150

6,9

20500 45,5 фракция с формой 2

0,8

21,5

9700

7,5

Гель-фильтрация на сефадексе

G-200

Изоэлектрическое фокусирование: фракция с >формой 1

Гель-фильтрация на ,сефарозе 6В

Ионнообменная хроматография на

ЦЕЛЕ-целлюлозе: фракция с формой 1

Продолжение таблицы

1359298

1б

12 юа Вормс 7

1359298

Фориа ) Форма g

Составитель Е.Воробьева

Техред Л.Сердюкова

Корректор И.Эрдейи

Редактор И.Рыбченко

Заказ 6115/26

Тираж 500

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4