Способ получения аденовирусных антигенов

 

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной вирусологии , в частности к технологии получения антигенных препаратов аденовирусов . Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа получения аденовирусных антигенов. Для этого аденовирусы выращивают в культуре клеток человека и животных, отделяют зараженные клетки от культуральной среды, извлекают антиген дистракцией сначала буферным раствором хлорида натрия, а затем дополнительной экстракцией 5М раствором хлорида натрия, после чего экстракт обрабатывают органическим растворителем и дополнительно объединяют с культуральной жидкостью, а очистку и концентрирование осуществляют двухступенчатой сорбционной хроматографией сначала на фенилсефарозе, а затем на ДЕАЕ-сефарозе. В результате указанных манипуляций достигается высокая частота аденовирусного антигена (), а его выход увеличивается в 1,5-2 раза. 1 табл. е (Л W Од Од 4) 00 4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК. (19) (11) А1 (51)4 А 61 К 39/00, С 12 N 7/00

OflHCAHHE ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕНКЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4087052/30-13 (22) 08,07.86 (46) 07.01.88. Бюл. 9 1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной молекулярной биологии и генетики ВАСХНИЛ (72) С,Н,Хилько, Т.И.Пономарева, В,Г.Григорьев, Ю.С.Комаров, О.В.Карпова и Т.И.Тихоненко (53) 616.988.75(088.8) (56) Boulanger P.À., Puvion F. Largescale preparation of soluble adenovirus hexon penton and fiber antigens in highly purified form. — Eur.

I. Biochem., 1973, 39, р. 37-42. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОВИРУСНЫХ

АНТИГЕНОВ (57) Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной вирусологии, в частности к технологии получения антигенных препаратов аденовирусов, Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа получения аденовирусных антигенов, Для этого аденовирусы выращивают в культуре клеток человека и животных, отделяют зараженные клетки от культуральной среды, извлекают антиген дистракцией сначала буферным раствором хлорида йатрия, а затем дополнительной экстракцией

5М раствором хлорида натрия, после чего экстракт обрабатывают органическим растворителем и дополнительно объединяют с культуральной жидкостью, а очистку и концентрирование осуществляют двухступенчатой сорбционной хроматографией сначала на фенилсефарозе, а затем на ДЕАЕ-сефарозе. В результате указанных манипуляций достигается высокая частота аденовирусного антигена (957), а его выход увеличивается в 1,5-2 раза. 1 .табл.

l5

1 136

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной вирусоло-гии, в частности к технологии получения антигенных препаратов аденовирусов.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта и упрощение способа, Пример 1, Монослой перевиваемой культуры клеток человека линии

Нер-2 выращивают во вращающихся бутылях объемом 2 л в устройстве для роллерного культивирования клеток.

Для выращивания клеток используют среду 199 с 107. сыворотки крупного рогатого скота. На сформированный мо-. нослой клеток Нер-2 (20 бутылей по

60 млн. клеток) наносят инфекционный аденовирус человека типа 1 (АЙЬ1) в дозе 0,05 бляшкообразующих.единиц на клетку в полном объеме поддерживающей среды (100 мл среды 199 с 2Х аминопептида на бутыль). Через 72 ч, когда весь монослой поврежден цитопатическими изменениями, среду культивирования сливают, а в бутыли добавляют по 10 мл 10 M натрий-фосфатного буфера, РН 7,2 и снимают клетки со стекла с одновременным их лизисом путем встряхивания.

Суспензию лизированных клеток (общий объем 120 мл) гомогенизируют в механическом ножевом размельчителе в течение 2 мин, после чего добавляют . 200 мл 5 M раствора NaC1 и дополнительно гомогенизируют 2 мин. К гомогенату добавляют 200 мл четыреххлористого углерода и встряхивают на лабораторном шейкере в течение 5.мин, после чего смесь разделяют центрифугированием в течение 15 мин, при

1500 об/мин, Верхнюю водную фазу (объем 395 мл) собирают и объединяют со средой культивирования (объем

950 мл). Объединенную фракцию подкисляют до РН 6,4 добавлением 1 М

БаН РОд и наносят на колонку (диаметр 5 см, высота слоя сорбента 6 см), содержащую фенилсефарозу CL-4B ("Фармация", Швеция) и уравновешенную 10 М натрий-фосфатным буфером (РН 6,4), со скоростью 1400 мл/ч. Колонку промывают с той же скоростью 1 л 10 M натрий-фосфатного буфера (РН 7,2), после чего элюируют антиген 307-ным этанолом íà 10 M натрий-фосфатном буфере (рН 7,2),со скоростью 200 мл/ч.

В элюл е регистрируют наличие белков

4342 2 по поглощению при 280 нм. Белковый пик объединяют в одну фракцию (объем

185 мл) и подвергают дальнейшей очистке.

Для этого элюат с фенилсефарозы наносят со скоростью 200 мл/ч на колонку ДЕАЕ-сефарозы (2,6 х 6 см), уравновешенную 10 М натрий-фосфатным буфером (РН 7,2). Далее колонку промывают с такой же скоростью 200 мл

10 М натрий-фосфатного буфера (РН

7,2), содержащего 0,2 M NaC1. Элюцию антигена с ДЕАЕ-сефарозы проводят линейным повышением концентрации

NaC1 от 0,2 до 0,4 M на 10 M натрийфосфатном буфере (РН 7,2), Общий объем градиента 160 .мл, скорость элюции

30 мл/ч. Фракции объемом 3 мл собирают с помощью автоматического кол" лектора фракций, В полученных фракциях определяют содержание антигена с помощью ракетного иммуноэлектрофореза в агарозе с антисывороткой против гексона аденовируса обезьян Ad sim 16, содержание суммарного белка опреде ляют методом Лаури и степень чистоты антигена — с помощью дискэлектрофог реза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

Результаты получения антигена проиллюстрированы в таблице °

Выход очищенного антигена Ad h1 соответствует 16 мг на 10 клеток (таблица, пункт 5), тогда как по известному способу максимальный выход составляет 9 мг на 10 клеток, Кроме основной фракции очищенного

40 антигена (таблица, пункт 5 ),, на носХ леднем этапе получают его дополнительные фракции, содержащие частично очищенный антиген (таблица, пункты 5

6 и 5 ), который может быть получен в очищенном состоянии путем повторной хроматографии на анионообменнике (пример 2), Аналогичным способом могут быть очищены антигены аденовирусов обезьян и крупного рогатого ско50

Пример 2. Монослой первичной культуры клеток почки зеленой мартышки (ПЗМ) выращивают в плоских культуральных флаконах объемом 1,5 л в

55 среде, Указанной в пРимеРе 1. На сформированный слой клеток ПЗМ (60 сосудов по 25 млн, клеток) наносят инфекционный аденовирус низших обезьян SA7 (Ad sim 16 (клон МБ-230) в з 13 дозе 0,02 бляшкообразующих единиц на клетку в полном объеме поддерживающей среды (150 мл среды, согласно примеру 1, на флакон). Через 96 ч культуральную среду сливают, клетки снимают и экстрагируют из них антиген, как указано в примере 1. Хроматографическую очистку антигена из объединенной фракции среды культивирования и экстракта клеток ведут, как указано в примере 1, за исключением того, что объединенную фракцию подкисляют до рН 6,0, а размеры хроматографических колонок увеличивают (высота слоя сорбента соответственно 10 и 15 см для фенилсефарозы и ДЕАЕ-сефарозы), Колонку ДЕАЕ-сефарозы промывают 500 мл

10 М натрий-фосфатного буфера (рН

7,2), содержащего 0,07 M NaC1, а элюцию ведут градиентом концентрации

NaC1 от 0,07 до 0,2 М на 10 M натрийфосфатом буфере (общий объем градиента 350 мл). Собирают фракции объемом 7 мл. Пик очищенного антигена (фракции 25-36) объединяют. Фракции частично очищенного антигена (21-24 и 37-42) объединяют, (общий объем

68 мл), разбавляют до 200 мл 10 М натрий-фосфатным буфером и наносят на колонку 2,6 х 8 см ДЕАЕ-сефарозы, уравновешенной 10 М натрий-фосфатным буфером, содержащим 0,07 М NaC1. Колонку промывают 150 мл того же буфера, после чего элюируют антиген линейным градиентом концентрации NaC1

0,07-0,2 М на 10 M натрий-фосфатном буфере (рН 7,2). Общий объем градиента 200 мл, собирают фракции по

5 мл. Очищенный антиген выходит во фракциях 21-26. Эти фракции объединяют с очищенным антигеном с 1-й колонки ДЕАЕ-сефарозы, Общий объем препарата, очищенного гексонового антигена 110 мл, содержание гексона

Ad sim 16 †. 84 мг, Для удаления солей и концентрирования очищенного антигена проводят хроматографию на фенилсефарозе, Для этого объединенную фракцию наносят . на колонку фенилсефарозы (1,6 х х 12 см), уравновешенной 10 М натрийфосфатным буфером (рН 6,4), со скоростью 10 мл/ч, Колонку промывают с той же скоростью 50 мл 5 M NH4COOCHg после чего элюируют сконцентрированный антиген 307-ным этанолом на дистиллированной воде со скоростью

20 мл/ч. Белковый пик (по поглощению

64342 антигены аденовирусов сохраняют полную антигенность и иммуногенность и могут применяться в качестве. диагностических и вакцинных препаратов.

Формула изобретения

Способ получения аденовирусных антигенов, включающий выращивание аденовирусов в культуре клеток, отделение зараженных клеток от культуральной жидкости, разрушение клеток путем лизиса и извлечение аденовирусного антигена экстракцией буферным раствором хлорида натрия, обработку экстракта органическим растворителем с последующей очисткой и концентри50

55 при 280 нм) собирают в одну фракцию (объем 25 мл) и подвергают лиофильной сушке. Выход антигена 80 мг, что

g соответствует 53 мг на 10 клеток, содержание гексона Ad sim 16 — 977.

Пример 3. Монослой культуры клеток МДВК выращивают во вращающихся бутылях объемом 500 мл в устройстве для роллерного культивирования клеток в среде, укаэанной в примере 1. Заражают клетки (20 бутылей по 20 млн. клеток) препаратом инфекционного аденовируса крупного рогатого скота

Ad Ъоа3) (0,01 БОЕ/клетку) в поддерживающей среде (50 мл на флакон). Через 120 ч среду сливают, а антиген из клеток экстрагируют, как указано в .примере 1, Хроматографическую очистку антигена проводят, как опйсано в примере 1, за исключением тоЬо, что элюцию антигена с фенилсефарозы проводят 207.-ным изопропанолом на 10 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,2), На

25 этапе ДЕАЕ-сефарозы используют концентрации NaC1, указанные в примере

2. Очищенный антиген Ad bos 3 (объем

38 мл) концентрируют. Для этого к препарату добавляют 100 мл охлажден30 ного до О С ацетона, смешивают и оставляют смесь на 1 ч при -20 С. После этого осадок антигена отделяют центрифугированием (20 мин при

3000 об/мин при 0 С) и растворяют в

3 мл О, 15 М NaCl. Выход антигена Ad Ьоз 3 - 81 мг (что соответствует

20 Mr/10 клеток), чистота 96Х.

Д

Предлагаемый .способ получения антигена обеспечивает повышение вы4р хода препарата в 2-5 раэ по сравнению с известным способом.

Полученные предлагаемым способом т

Характеристика

Гексон в

Объем, Белок, Антиген мл мг (гексон), мг

Выход антиЭтап выделения гена, Х ОТ препарате, . исходного

1 Среда культивирования 950 3230 23

0,71 48

2 Экстракт клеток

395 350 25

6,9 52

3 Объединенный исходный препа1,3 100

1345 3580 48 рат

4 Элюат с фенилсефарозы

14,3 88

185 292 42

5 Элюат с ДЕАЕсефарозы а) фракции

25-27

8,5 14, О 7,6 51 15 б) фракции

28-34

20,5 20,0 19,2 95 40 в) фракции

35-40

17,0 27,8 10, 1 36 21 (46) (61, 8) (36, 9) (74) (76) r) сумма (а + б + в) Составитель С,Светлышев

Корректор Л.Пилипенко

Техред Л. Олийнык

Редактор Е,Папп

Заказ 6505/5 Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений-и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1364342 6 рованием сорбционной хроматографией, ционную хроматографию проводят с исотличающийся тем, что, с пользованием фенилсефарозы с рН 6,0целью повышения выхода целевого про- 6,4, при этом элюцию осуществляют дукта и упрощения способа, при извле-,. 30 -ным раствором этанола или 20 ;ным

6 чении аденовирусного антигена осуще- раствором изопропанола с последующей ствляют дополнительную экстракцию сорбцией элюэнта на ДЕАЕ-сефарозе и

5 М раствором хлорида натрия, после элюцией антигена 10 М натрий-фосфатобработки экстракта органическим рас- ного буфера рН 7,2 с линейным повышетворителем его дополнительно объеди- 10 нием концентрации в нем хлористого няют с культуральной жидкостью, сорб- натрия от 0,2 до 0,4 М.