Реактив для турбидиметрического определения липазы

 

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к реактиву для определения липазы особенно турбидиметрическим методом. Цель изобретения - повьшение чувствительности реактива для определения липазы . Сухой реактив для турбидиметрического определения липазы содержит защитный коллоид и жидкий триглицерид (в котором остатки жирных кислот имеют 8-20 углеродных атомов и 1-8 углерод-углеродных двойных связей ). В качестве защитного коллоида используют мономерную пентозу или гексозу, или полимер, содержащий пентозных или гексозных групп, или твердый полиэтипенгликоль. Защитный коллоид включает также сахарный спирт, полиэтиленгликоль. Жидкий триглицерид содержит также триолеин, глицерин-три-октаноин, глицерин три- 2-октаноин, глицерин-три-тетраделаноин, глицерин-три-2,4,6,8-тетрадеканоин, глицерин-три-эйкозаноин. В качестве защитного коллоида реактив дополнительно содержит альбумин крупного рогатого скота. Реактив дополнительно содержит азид натрия, калиевую или натриевую соль желчной кислоты , колипазу, буферное вещество рН 6,0-10,0 из группы диили триэтаноловых буферных веществ, активатор (из группы хлоридов). Реактив обладает повышенной чувствительностью и имеет более высокую воспроизводимость и стабильность результатов за счет стабилизации экстинции при фотометрическом измерении. СО 05 vl 00 О5 4j

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЩЕЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

I5D 4 0 О1 N 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н AATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (2I) 2872054/28-14 (22) 23.01.80 (31) P 2904305.8 (32) 05.02.7 9 (33) DE (46) 15.01.88. Бюл. К- 2 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (ВЕ) (72) Ульрих Нойманн, Карл-Вольфганг

Книч, Йоахим Цигенхорг, Альберт Редер, Вернер Цвец и Вернер Кремер (DE) (53) 577.15.082.153.2(088.8) .(56) Заявка Франции М 2350604, кл. G 01 N 33/16, 1978. (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКОГС

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПАЗЫ (57) Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к реактиву для определения липазы особенно турбидиметрическим методом. Цель изобретения — повышение чувствительности реактива для определения липазы. Сухой реактив для турбидиметри.ческого определения липазы содержит защитный коллоид и жидкий триглицерид (в котором остатки жирных кислот имеют 8-20 углеродных атомов и

„,SU „„1367867 А 3

1-8 углерод-углеродных. двойных связей). В качестве защитного коллоида используют мономерную пентозу или гексозу, или полимер, содержащий

2-10 пентоэных или гексозных групп, нли твердый полиэтиленгликоль. Защитный коллоид включает также сахарный спирт, полиэтиленгликоль. Жидкий триглицерид содержит также триолеин, глицерин-три-октаноин, глицерин три2-октаноин, глицерин-три-тетраделаноин, глицерин-три-2,4,6,8-тетрадеканоин, глицерин-три-эйкозаноин. В качестве защитного коллоида реактив дополнительно содержит альбумин крупного рогатого скота. Реактив дополнительно содержит азид натрия, калиевую или натриевую соль желчной кислоты, колипазу, буферное вещество рН 6,0-10,0 из группы ди- или триэтаноловых буферных веществ, активаФ тор (из группы хлоридов). Реактив об- вша ладает повышенной чувствительностью фр и имеет более высокую воспроиэводимость и стабильность результатов sa счет стабилизации экстинции при фотометрическом измерении.

С5

1367867 зр

В качестве триглицерида используют как естественные, так и синтетиче- 40 ские триглицериды с остатками жирных кислот между 4 и 22 С-атомами. Пригодным является также трибутирин. Наиболее предпочтительны триглицериды с длинноцепочечными остатками ненасыщенных жирных кислот, в особенности триглицериды, остатки жирных кислот которых имеют 8-20 С вЂ” атомов и 1-8, ! .преимущественно 1-3, углерод-углерод двойных связей. Благодаря легкой дос- р тупности особенно предпочтительным является триолеин, также можно использовать оливковое масло. Предпочтительное количество триглицерида составляет 0,2-2,0 мас.7.

В качестве защитного коллоида используют полигидроксисоединения, сывороточный альбумин, поливинилпнрролидон, твердые полиэтиленоксиды.

Изобретение относится к клиничес-, кой биохимии, а именно к реактиву для определения липазы особенно тур. бидиметрическим методом.

Цель изобретения — повышение чувствительности реактива для определения липазы.

Способ осуществляется следующим образом, 10 .Сухой реактив для турбидиметрического определения липазы, содержащий защитный коллоид и жидкий триглицерид, при этом в качестве защитного коллоида содержит мономерную пентоэу или гексозу, или полимер, содержащий 2-10 пентозных нли гексозных групп, или твердый полиэтипенгликоль, в качестве жидкого триглицерида используют такой, в котором остатки 2р жирных кислот имеют 8-20 углеродных атомов и 1-8 углерод-углеродных двойных связей, дополнительно содержит азид щелочного металла, калиевую соль желчной кислоты, колипазу, мо- 25 чевину, буферное вещество рН 6,0 при следующем соотношении компонентов

Жидкий триглицерид 0,47-6,58

Калиевая соль желчной кислоты 13,5-34,4

Колипаза . 0,0065-0,05

Азид щелочного металла 0,36-0,87

Иочевина 3,82-28,29

Буферное вещество 4,85-12,6

Активатор 0,22-3,25

Защитный коллоид Остальное

Предпочтительными примерами пригодных полигидроксисоединений являют ся маннит и подобные многоатомные спирты, олигосахарид глюкозы, манноза, мальтогептоза, полиэтиленгликоль со средним молекулярным весом между

3500 и 7000 и др.

Защитными коллоидами являются такие аминокислоты, как алании, а также гуммиарабик. Предпочтительным количеством защитного коллоида соответственно смеси защитных коллоидов является 50-70 мас.X. В качестве особенно пригодной оказалась смесь сахарного спирта и полиалкиленгликоля.

В качестве желчных кислот принимаются во внимание известные поверхностно-активные желчные кислоты, как холевая кислота, таурохолевая кислота, дезоксихолевая кислота соответственно их соли щелочных металлов, в особенности натриевая соль. Предпочтительное количество составляет

l0-15 мас.X.

Дальнейшей существенной составной частью предлагаемого реактива является колипаза. Особенно пригодной является свободная от примесей колипаза. Предпочтительное количество составляет 0,003-0„01 мас.X.

В качестве консервантов используют такие, которые не нарушают ферментативную активность подлежащей определению липазы. Особенно пригодными являются азиды щелочных металлов, в особенности аэид натрия. Однако пригодными являются также другие консерванты, как например тиозид, и другие серосодержащие консерванты. Предпочтительное количество консерванта составляет 0,2-0,7 мас.Ж.

Реагент содержит еще мочевину, предпочтительно 10-.15 мас.X.

В качестве буферного вещества пригодны все известные буферы, которые в состоянии в рамках предлагаемого ,реактива устанавливать рН между 0,6 и 10,5. Предпочтительная область рН между 8,3-и 9,5. Примерами пригодного буфера являются диэтаноламинный буфер, триэтаноламииный буфер, Trisбуфер и Соотг-буфер, как Нерея-буфер (пригоден для добавки перед лиофилизацией), Taps"буфер и Bicine. Предпочтительным является Tris-буфер.

Предпочтительное количество буфера

3 и 1О мас.X. Дальнейшим активатором являются ионы кальция. Так как

1367867 4 к лиофилизату непосредственно после его получения или немного позднее.

Пример 1. 0,06 r СаС1

22,72 r дезоксихолата натрия, 25,35 r полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 1,1 r азида натрия, 0,02 r колипаэы и 50,8 r маннита растворяют в 1,0 л дистиллированной воды, В полученный раствор при перемешивании с давлением 2 бара через сопло диаметром 1,5 мм впрыскивают 1,42 r триоленина, растворенные в 32 мл н-пропано" ла. Полученную триолеиновую эмульсию замораживаит при -40 С и сушат путем лиофилизации.

8,95 г дезоксихолата натрия, 7,25 г Tris 1,20 г Tris-HC1, 7,5 r полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 1,97 г NaC1, 16,2 г мочевины и 56,9 г маннита смешивают друг с другом в сухом состоянии, 2 мас.ч. полученной буферной смеси с помощью спирального смесителя смешивают с

1 мас.ч. лиофилизата в гомогенный реактив.

Для проведения определения липазы к 150 мг этого реактива добавляют

2,5 мл воды, смешивают с О,1 мл пробы и фотометрически измеряют при

365 нм при 25 С по отношении к воде.

В качестве пробы пригодными являются, например, сыворотка крови, содержимое двенадцатиперстной кишки, моча и другие жидкости организма, Правильность метода проверяют путем сравнения с титраметрическим методом по Рикку. При изучении 60 серий человеческой липазы различной активности получались следующие данные: корреляция: (х = Рикк, у — тест согласно изобретению) у = 0,93, х-20» г-0,96.

Линейность теста остается получающейся до примерно 1300 единиц по Рикку °

Одна единица по Рикку = 1 моль

FFA/мин = 1 . FFA — высвобождающиеся жирные кислоты.

I они с дезоксихолевой кислотой дают нерастворимые соединения, в присутствии кальция в качестве желчной кислоты предпочтительной является тауро5 дезоксихолевая кислота, так как она допускает более высокие концентрации кальция в области 1-5 ммоль.

Предлагаемый реактчв содержит также активатор для липазы. Активаторы )p липазы являются известными. Предпоччительными являются хлориды, в особенности хлорид натрия, но также другие хлориды щелочных или щелочноземельных металлов, поскольку они )5 не ведут к образовании нерастворимых

1 соединений с другими составными частями реактива или пробы. Активируище действуют также ионы магния.

Сухой реактив получают путем лио- )p филизации одной из составных частей эмульсии, полученной обычным методом.

При этом буферное вещество, мочевина и в данном случае также часть защитного коллоида и консерванта, а также активатора преимущественно добавляют к "сухой эмульсии" лишь после лиофилизации. Подвергнутая лиофилизации эмульсия может почучаться обычным методом, например путем внесения ЭО всех составных частей в водный растворитель, эмульгирования с помощью обычных методов, как ультразвук и т.п. и в заключение замерзания при с около -40 С и сушки в вакууме при обычных условиях (1Π— 10 торр).

При лиофилизации должны быть добавлены соль желчных кислот, колипаза, минимум 20 мас.X защитного коллоида, 4р минимум часть консерванта и в данном случае активатор. Предпочтительный способ получения водной эмуль сии, определенной для лиофилизации, состоит в том, что названные составные части, исключая триглицерид, растворяют в воде и затем при перемешивании в раствор сильной струей впрыскивают раствор триглицерида в летучем органическом растворителе. gp

В качестве летучего органического растворителя при этом пригодны в особенности алифатические спирты и кетоны с чиспом углеродных атомов 1-4.

Остальные составные части предлагаемого реактива, а именно буферное вещество, мочевина и в данном случае остальной защитный коллоид, консервант и активатор, могут добавляться

Пример 2. 1,500 r маннита

0,900 г полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 0,524 г дезоксихолата натрия, 1,5.мл колипазы и 8 мг азида натрия растворяют в 50 мл дис- тиллированной воды. В этот раствор при перемешивании через мелкое сопла впрыскивают 150 мг триолеина, растворенные в 5,0 мл пропанола. Полу136786

6,58

56,05 ченную эмульсию замораживают при

-40 С и лиофилизируют.

3„50 r мочевины, 3,73 r дезоксихолата натрия, 0,40 г NaC1, 0,10 г азида натрия, 2 мг карбоната кальция, 2,355 r Tris и 0,200 г Tris-НС1 интенсивно перемешивают друг с другом.

К этому добавляют измельченный сухой лиофилизат и гомогенно перемешивают. 10

Комплексная смесь = 8,219 г содержит: маннит 1,500 г; полиэткпенгликоль 0,900 r сумма = 2,4 г =

= 29,2 мас.%; дезоксихолат натрия

4,254 r = 51,7 мас.%; колипаза 15

1,5 мг; азид натрия 9 мг; Tris-буфер

У

1,355 г; Tris-HCl 0,200 r сумма =

1,555=18,9 мас.%; мочевина 3,5 r= — 42,5 мас.%.

37 мг этой смеси растворяют в 20

2,5 мл дистиллированной воды и фотометрически измеряют с 200 мл пробы (сыворотки) при 340 нм и 25 или 30 С по отношению к воде или воздуху. Из разности ослабления в минутах проводят определение активности липазы.

Пример 3. 8,41 г альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 12,2 г дезоксихолата натрия, 0,02 r азида натрия и 0,034 г колипазы раст- 30 воряют в 100 мл дистиллированной воды. При перемешивании в этот раствор под давлением впрыскивают раствор

3,5 г триолеина в 7 мл пропанола.

Полученную эмульсию замораживают при

-40 С и лиофилизируют.

17,4 г маннита, 4 r полиэтиленгликоля твердого, 7 г мочевины, 7,47 r дезоксихолата натрия, 0,82 r

NaCl, 0,2 г азида натрия, 2,71 r

Tris и 0,4 r Tris-HC1 размалывают и интенсивно смешивают друг с другом.

К этому добавляют измельченную сухую эмульсию и все гомогенно перемешивают. 45

90 мг этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллированной воды и после растворения смешивают со 100 мл пробы (сыворотки).

Реакция проводится при 340 (365) нм

Н фотометрически.

Пример 4. .8,41 г аланина, 1,22 г дезоксихолата натрия,0,02 г азида натрия и 0,034 г колипазы растворя- g6 ют в 100 мп дистиллированной воды,при перемешивании в этот раствор под давлением впрыскивают раствор 3,5 г триолеина в 7 мл пропанола. Полученную

6 эмульсию замораживают при -40 С и лиофилизируют.

17,4 г, маннита, 4 г твердого полиэтиленгликоля, 7 г мочевины, 7,47 г дезоксихолата натрия, 0,82 r NaC1, 0,2 г азида натрия, 2,71 г Tris u

0,4 г Tris-НС1 измельчают и интенсивно смешивают друг с другом. К это" му добавляют измельченную сухую эмульсию и гомогенно перемешивают.

90 мг этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллированной воды и после растворения смешивают со 100 мл пробы (сыворотки), Реакцию проводят при 340 (365) нм Н> фотометрически.

Пример 5. 4,205 r полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 4,205 г альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 1,22 г дезоксихолата натрия, 0,02 r азида натрия и

0,034 г колипазы растворяют в 100 мл дистиллированной воды. При перемешивании в этот раствор под давлением впрыскивают раствор 3,5 г триоленина и 7 мл пропанола. Полученную эмульсию замораживают при -40 С и лио-. филизируют.

17,4 r маннита, 4 r полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 7 r . мочевины, 7,47 г дезоксихолата натрия, 0,82 r ИаС1, 0,2 г азида натрия, 2,71 r Tris и 0,4 Tris-HCl измельчают и интенсивно смешивают друг с другом.

К этому добавляют измельченную сухую эмульсию и гомогенно перемешивают.

90 мл этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллированной воды и после растворения смешивают со 100 мл пробы (сыворотки).

Реакцию проводят фотометрически при

340 (365) нм Н>.

Пример 6. Рецептура дана в мас .%:

Триглицерид 0,47

Защитный коллоид 68,00

Калиевая соль желчной кислоты 13,48

Колипаз а 0,0066

Азид щелочного металла 0,36

Иочевина 10,75

Буферное вещество 5,61

Активатор 1 33

Пример 7. Рецептура дана в мас.%:

Триглицерид

Защитный коллоид

13678

Формула изобретения

0,36-0,87

4,85-12,6

0,22-3,25

Остальное

Составитель Л.Конюхова

Редактор Н.Киштулинец Техред А.Кравчук Корректор М.Пожо

Заказ 6856/58 Тираж 847 Подписка е

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Калиевая соль желчной кислоты 16, 34

Колипаз а 0,06

Азид щелочного металла 0 41

Мочевина 13,16

Буферное вещество 5,85

Активатор 1,54

Предлагаемый реактив обладает более высокой чувствительностью в сравнении с известным, а также имеет более высокую воспроиэводимость и стабильность результатов за счет стаби- лизации экстинкции при фотометрическом измерении.

Реактив для турбидиметрического 20 определения липазы, содержащий в качестве защитного коллоида пентозу, гексозу, сахарный спирт, полиэтиленгликоль или их смесь и жидкий триглицерид, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности реактива, в качестве жидкого триглицерида реактив содержит триоле67 8 ин, глицерин-три-октаноин, глицерин три-2-октаноин глицерин-три-тетраделаноин, глицерин-три-2,4,6,8-тетрадеканоин, глицерин-три-эйкозаноин или глицерин-три-2,4,6,8,10 12,14,16эйкозаноин, в качестве защитного коллоида дополнительно содержит альбумин крупного рогатого скота, и кроме того, реактив дополнительно содержит азид натрия, калиевую или натриевую соль желчной кислоты, колипазу, бу-, ферное вещество рН 6,0-10,0, выбранное из группы: ди- ипи три-этаноловых буферных веществ, активатор, выбранный из группы: хлористая соль натрия, кальция или магния, при следующем соотношении компонентов,мас.7.:

Жидкий триглицерид 0,47-6,58

Калиевая соль желчной кислоты 13,5-34,4

Колипаза 0,0065-0,05

Мочевина 3,82-28,3

Азид щелочного металла

Буферное вещество

Активатор

Защитный коллоид