Способ стабилизации синаптосом

 

Изобретение относится к физикохимической биологии, касается способа устранения повреждения биологических мембран, вызванных действием фосфолипаз, и предназначен для оптимизации длительного хранения препаратов биологических мембран. Цель изобретения - упрощение способа за счет сокращения числа операций при одновременн ом сокращении времени инкубации . Для этого к суспензии синаптосом добавляют спиртовой р-р альфатокоферола из расчета 10 ,моль/мг синаптосомального белка и инкубируют 3-5 мин. Объем добавленного этанола не должен превышать 1%. 1 табл. S сл

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1383204 А 1 (д) 4 G 01 N 33/48

„:Я

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ц/

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4077931/28-14 (22) 11.06.86 (46) 23,03.88. Бюл. У 11 (71) Институт клинической психиатрии

Всесоюзного научного центра психического здоровья АМН СССР (72) Л.Л.Прилипко, В.Е.Каган, А.Н.Ерин и В.И.Скрыпин (53) 612.015 (088.8) (56) Прилипко Л.Л. Роль процессов перекисного окисления липидов в повреждении мембранных структур мозга при стрессе и гипероксии. Автореф. дис. д-ра биол. наук. М., 1983, с.24. (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ СИНАПТОСОМ (57) Изобретение относится к физикохимической биологии, касается способа устранения повреждения биологических мембран, вызванных действием фосфолипаз, и предназначен для оптимизации длительного хранения препаратов биологических мембран. Цель изобретения — упрощение способа за счет сокращения числа операций при одновременном сокращении времени инкубации. Для этого к суспензии синаптосом добавляют спиртовой р-р альфатокоферола из расчета 10 моль/мг синаптосомального белка и инкубируют

3-5 мин. Объем добавленного этанола не должен превьппать 1Х. 1 табл.

1383204

Изобретение относится к области биологии, в частности к физико-хими4 ческой биологии, касается способа устранения повреждения биологических мембран, вызванных действием фосфолипаз, и может быть использовано для оптимизации длительного хранения препаратов биологических мембран.

Цель изобретения — упрощение спо,соба за счет сокращения числа операций при одновременном сокращении вре,мени инкубации.

Способ осуществляют следующим образом.

К суспензии синаптосом добавляют спиртовой раствор альфа-токоферола из расчета 10 моль/мг синаптосомального белка и инкубируют 3-5 мин, Объем добавленнбго этанола не должен превышать 1 .

Пример. Серое вещество мозга крыс Вистар гомогенизируют в среде

Кребса-Рингера, затем центрифугируют

10 мин при 3000 g для удаления ядер и неразрушенных клеток. Полученный супернатант центрифугируют в градиен.те плотности (0,3 и 0,8 M) сахарозы

1 при 10000 g 20 мин для отделения миf0

25 тохондрий, которые соответствуют плот-30 ности 0,3 М сахарозы. Слой 0,8 М сахарозы, содержащий синаптосомы, отделяют и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин, а затем ресуспендируют в среде Кребса-Рингера. К 1,мл полученных таким образом синаптосом, обработанных фо сфолипа з ой А,(300 мк r белка, степень обработки соответствует 7-25 ) добавляют 3 10 моль аль8 фа-токоферола в 10 мкл этанола и ин- 40 кубируют 4 мин.

Важнейшей структурно-функциональной характеристикой мембран синаптосом является их трансмембранный потенциал. Обработка синаптосом фосфо- 45 липазами А, С или D приводит к изменению величины трансмембранного потенциала, оцениваемой по изменению флуоресценции потенциал-чувствительного флуоресцентного зонда 3,3-дипропил-2,2-тиокарбоцианида (di-S-С -(5).

Действие фосфолипаз А, С или П приводит к увеличению интенсивности потенциал-зависимой флуоресценции di$-С g (5), что соответствуе т снижению величины трансмембранного потенциала.

При 7-10 гидролиза фосфолипидов фосфолипазами А<, С или D наблюдается максимальная деполяризация синаптосом. Через 3-5 мин после введения альфа-токоферола в количестве

-E

10 моль/мг синаптосомального белка наблюдается снижение величины потенциал-зависимой флуоресценции di-S-C (5) до исходного уровня, т.е. полное восстановление величины трансмембранного потенциала, сниженной в результате действия фосфолипаз, что свидетельствует об устранении их повреждающего действия.

Другой важной характеристикой синаптических мембран, определяющей подвижность мембранных рецепторов и регулирующей активность интегральных ферментов, является микровязкость липидного бислоя.

В таблице указано изменение времени вращательной корреляции нитроксилсодержащего эфира стеариновой кислоты °, встроенного в мембраны синаптосом мозга крыс, при действии фос- фолипаз и e -токоферола при 37 С.

Из данных, представленных в таблице, видно, что обработка фосфолипазами А и С, соответствующая 20-25 гидролиза фосфолипидов, ведет к снижению микровязкости липидного бислоя синаптосом, оцениваемой по времени вращательной корреляции спинового зонда — нитроксил-содержащего эфира. стеариновой кислоты. Аналогичная по интенсивности обработка фосфолипазов

D не приводит к изменению микровязкости липидного бислоя синаптосомальных мембран.

При 37 С уменьшение микровязкостй липидного бислоя мембран синаптосом выражается в снижении времени враща-3 тельной корреляции зонда с 2 5 -10 до 2,0 -10 с, Введение альфа-токоферола в количестве 10 моль/мг синаптосомального белка к синаптосомам, обработанным, фосфолипазами, приводит к увеличению микровязкости липидного бислоя. Это выражается в увеличении времени вращательной корреляции спинового зонда до 1 1, 0: »

«10 9 с. Таким образом, введением альфа-токоферола достигается увеличение микровязкости липидного бислоя мембран синаптосом, которая была снижена в результате действия фосфолипаз, что свидетельствует об устранении их повреждающего действия.

Предлагаемый способ обеспечивает быстрое и эффективное устранение повреждающего действия фосфолипаз раз1383204

Время вращательной корреляции зонда,, с

Воздействие

2,5.10 Интактные синаптосомы

Синаптосомы, обработанные фосфолипазой А

2,0.10

Синаптосомы, обработанные фосфолипазой С

2,0 -10

Формула изобретения

Сии алто сомы, обработанные фосфолипазой D

2;0 10, Синаптосомы, обработанные фосфолипазой А,, С или D + альфа-токоферол

Составитель Н. Гуляева

Редактор Н. Тупица Техред А. Кравчук Корректор И рдейи

Заказ 1288/40 Тираж 847 Подписное

MIHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 личного типа на синаптосомы мозга.

Преимущества предлагаемого способа— простота, высокие скорость и эффективность, широкий спектр действия.

Тот факт, что предлагаемый способ обеспечивает восстановление таких параметров, измененных при действии фосфолипаз, как микровязкость и трансмембранный потенциал, которые определяют структурно-функциональное состояние различных биологических мембран, означает, что он может быть использован для стабилизации различных мембранных препаратов от повреж- 15 дающего действия фосфолипаз.. В частности, данный метод может быть использован при длительном хранении препаратов биомембран, когда они повреждаются в результате действия эндо- 20 генных фосфолипаз.

Способ стабилизации синаптосом пу- 25 тем добавления в суспенэию синаптосом агента, связывающего продукты гидролиза фосфолипидов с последующей инкубацией, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа операций при одновременном сокращении времени инкубации, в качестве агента используют альфа-токоферол в этанольном раствот ре, взятый в соотношении 10 моль/мг синаптосомального белка, причем конечный объем этанола не превышает 17., а время инкубации составляет 4+1 мин.