Способ исследования функций митохондрий

 

Изобретение относится к биохимии, биофизике, точнее к биоэнергетике, предназначено для изучения in vitro механизма действия фармакологических и других биологически активных веществ на окислительное фосфорилирование и другие функции митохондрий. Цель изобретения - упрощение способа при одновременном сохранении физиологического состояния митохондрий. Для этого получают препарат митохондрий из биологического объекта (например, печени), инкубируют в среде с 0,1-0,15 М NaCl и 0,005-0,015 М однозамещенным фосфатом калия при рН 7,5. Измеряют характеристики окислительного фосфорилирования. Предлагаемый способ при его упрощении, обеспечиваемом уменьшением числа компонентов в среде инкубации , обеспечивает сохранение и даже улучшение функциональных свойств митохондрий при их исследовании. 4 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1

„„SU„„1386900 (51)4 С 01 N 33/48

®Qr(g„...

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР г10 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Н ASTOPGHOINY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4021749/28-14 (22) 12.02.86 (46) 07.04.88. Бюл. 13 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины и Институт биохимии AH ЛитССР (72) М.Д. Черкасская, А.А. Матулис и А.А. Ясайтис (53) 612..015(088.8) (56) Методы в биохимии. Вильнюс, 1975, с. 329. (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИЙ NATOХОНДРИЙ (57) Изобретение относится к биохимии, биофизике, точнее к биоэнергетике, предназначено для изучения in vitro механизма действия фармакологических и других биологически активных веществ на окислительное фосфорилирование и другие функции митохондрий. Цель изобретения — упрощение способа при одновременном сохранении физиологического состояния митохондрий. Для этого получают препарат митохондрий из биологического объекта (например, печени), инкубируют в среде с 0,1-0,15 М NaC1 и 0,005-0,015 М однозамещенным фосфатом калия при рН 7,5. Измеряют характеристики окислительного фосфорилирования. Предлагаемый способ при его упрощении, обеспечиваемом уменьшением числа компонентов в среде инкубации, обеспечивает сохранение и даже улучшение функциональных свойств митохондрий при их исследовании. 4 табл.

С:. «86900

Изобретение относится к биохимии и биофизике, а именно к биологической ,энергетике, и может быть использовано

1 при изучении 1Il vltI о механизма действия фармакологических и других биоло" гически активных веществ на окислительное фосфорилирование и другие функции митохондрий.

Цель изобретения — упрощение спо- 10 соба при одновременном сохранении физиологического состояния мито-! хондрий.

Способ осуществляется следующим образом.. 15

Получают препарат митохондрий из биологического объекта (например, .печени), инкубируют в среде, содержащей О, 1-0, 15 М хлорид натрия и

0,005-0,015 М однозамещенный фосфат 20 калия, с рН 7,5 и измеряют характеристики окислительного фосфорилирования.

П р и м .е р 1. Из печени крысы получают препарат митохондрий, инку- 25 бируют в среде, содержащей 0,15 М

NaC1 и 0,01 М КН РО 4, и определяют

1 характеристики окислительного фосфорилирования. Одновременно проводят инкубацию в среде по известно- 30 му способу, содержащей 0,1 M сахарозу, О, 05 М КС1, 1,5 мМ трис-буфер и

0,01 М КН,РО,.

Данные окислительного фосфорилирования в средах инкубации митохондрий разного состава приведены в табл.1.

Пример 2. Исследуют окислительное фосфорилирование митохондрий в присутствии продигиозана (ПРГ) фармакологического препарата, известного как индуктора интерферона, Сведений об энергетических изменениях под влиянием этого препарата нет.

Продигиозан в пределах 5-25 мкг/мл активирует фосфорилирующее дыхание, значительно ускоряет фосфорилирование и увеличивает коэффициент эффективности окислительного фосфорилирования.

Данные влияния продигиоэана на окислительное фосфорилирование митохондрий печени крыс представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что проднгиоэай в пределах указанных концентраций (5-50 мкг/мл) повышает энергетическую эффективность митохондрий.

Результаты исследования влияния ионов Са + на эффект продигиозана на митохондрии приведены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что 50 мкмоль

Са +25 мкг/мл продигиозана несколько снижают величину ДК и коэффициента АДФ/О на фоне активации дыхания в безакцепторной системе и в койтролируемом состоянии, что свидетельствует о развивающемся разобщении окислительного фосфорилирования.

Данные изменения влияния продигиозана на окислительное фосфорилирование митохондрий с увеличением концентрации Са + представлены в табл.4.

Увеличение концентрации Са до

t00 мкмоль вызывает зависимое от дозы продигиозана нарастание фосфорилирующего дыхания, скорости фосфорилирования, величины ДК и коэффициента

АДФ/О.

Предлагаемый способ при упрощении, обеспечиваемом уменьшением числа компонентов в среде инкубации, обеспечивает сохранение и улучшение функциональных свойств митохондрий при их исследовании.

Формула изобретения

Способ исследования функций митохондрий путем выделения митохондрий из биологического объекта, инкубации изолированных митохондрий в среде, содержащей однозамещенный фосфат калия и соль соляной кислоты при рН

7 5, с последующим определением характеристик окислительного фосфорилирования, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью упрощения способа при одновременном сохранении физиологического .состояния митохондрий, используют среду, содержащую

О, 1-0, 15 М хлорнд натрия и 0,0050,015 М однозамещенный фосфат калия.

1386900

Продолжение табл.1

Та блица 1

Состав среды инкубации интактных митохондрий

Состав среды инкубации иоказат ли интактных митохондрий 5

Показатели

Сахароза

0,1 И+КС1

0,05М+трисбуфер 10

1,5 мМ+ .0,01 М КН РО

Изотонический раствор (0,15И)

NaC1+0,01 М

КНФРО4

V ф»

15 ммкАО/мин

ДК

АДФ/О

22

Количество

Активность

89,0 4,2 97,1+3,0

3,52+0 14 3,03+0,3

1,70+0,07 1,78+0,15

17,2И,4

15,6+0,7

П р и и е ч а н и e. V — скорость фосфорилирования;

АДФ вЂ” аденозинтрифосфат; ДНФ—

2,4-динитрофенол;

ДК вЂ” дыхательный коэффициент. состояние I. I I 56, 8+1 «6 59, 7+5, 7

16,8+0,9 20,8t2,3

79,9+2,7 83,9+4,8 состояние IV

+ДНФ

Таблица 2

Концентрация продигиозана, мкг/мл

Показатели

Активность дыхания, ммкАО/мин мг белка до добавки АДФ

15,6+0,7 16,710,7 16,8+0,9

56,8 1,6 55, 1+2, 1 65, 1+2, 1

18,0+0,8 р(0,05

60,6+2,7 состояние III

16,8+0,9 19,0+1,4 18,8+0,6 18,5+0,9

79, 9+2, 7 7 7, 6+ 5, 6 81 21 3, О 78, 4+ 5, 9 состояние IV

+ДНФ

V,,ммкАО/мин

89, О 4, 2 99, 1+ 5, 8

3,52+0,14 3,19+0,2

119, Х6,5 106,8+5,9 р(0,01 рг0,05

3,34+0,13 3,15+0,14

ДК

АДФ/О

1, 69 0, 07

2,04 0,09

1,99+0,ii

1,76+0,03

П р и м е ч а н и е. р — сравнительно с контролем, т.е. с интактными митохондриями без продигиозана в среде инкубации. дыхания,ммк

АО/мин мг белка: до добавки АДФ

Изотоиический раствор (0,15Ы)

NaC1+0,01 М

КН РО

Сахароза

0,1 И+КС1

0,05М+трисбуфер

1,5 мМ+

0,01 М КН РО

1 386900 табяниа 3

Добаехи нродигноэана, млг и Cs> ° мимо они- Алтиеноста дмлания, ммхАО/мил мг белла ест-ДВ АДФ/О о до добавим состояние состояние + сяу- АДФ III IV аеа

14 17,020>Ь 5S,Ot1 8

9 15,7+0,4 57,2t1,8

Са " 50

59>785,7

Сахароэная среда 7 17,2+1>4

10 16>720>7 55 ° ii2 ° 1

ПРГ 5

62,8r! 6

ПРГ 5 е Са" 50 6 18,321,4

2„О4+О,О9 рс0,01

3,34i0,13

65,182>2

25 16,8+0,9

ПРГ 25 р с0,01

ПРГ 25 + Са + 50 7 22>320,17 62,743 ° 2

116,4i9,6 2,70т0,13 1,7740,064

75,5t2,5

23,4t1,4 р с0,05 р с0,05 р с0,01 р 20,05

3,15+0,14 1,7680,03

106,8r5,9

78,415>9

18,560,9!

4 !S,Ot0,8

60,6+2,7

ПРГ 50 р с0,05

2>5410>12 1>72 0>04

100,6+4,0

77,5i3,0

23,5r0,7

P с0,01

59,582,6

6 19,5+1,Z

I1Pt 50 + Ca + р с0,05 р со,о!

П р н м е я а н и е. р - сравните>тьио с инталтными митолондриямн (беэ проднгноэана и беэ нонор Са>+)

Таблица 4

Показатели окислительного фосфорилирования добавки ПРГ> мкг, и Са2 мкмоль

Саа 100 ПРГ 5 + ПРГ 25 + ПрГ 50 +

+Ca" 100 +Са + 100 +Са + 100

16,5+1,2 17,5+0,9 16,0+0,6 20,0+1,7

43,1+1,9 48,4+1,4 54,113,0 58,2+3,9 р сО>05 р с 0 05 р с0,05

10,6+0>4 12,6+0>6 11,9 0>7 15,5+0,7 состояние III состояние IV р (0,01

+ДНФ

56,3+2,0

62,7+2,2

62,5+1,9 68,8+11,9

V, ммкАО/мин

87, 4+5, 3 107, 2i3 > 7 98, 9+6, 5 109, 1+1, 9 р 0>05 р (0,05

4,08+0,2 3,91+0,3 4,61+0,3 3,72+0,08

2,03+0>08 2>20+0,06 2,01+0,1 I>85+0>1

llK

АДФ/О

П р и м е ч а н и е ° р — сравнительно с влиянием

100 мкмоль кальция на интактные митохондрии (без продигиозана).

Активность дыхания, ммк АО/мин мг белка до добавки АДФ

17,7t4„1

18,4+1,3

20 ° 8+2,3 t9 Oi1,4

20,0i1>2

1S,В2О,6

75, li2>3

75,5>2,0

»

83,9 4>8

77,6+3,6

73,3 1 ° 7

81, 2+3 ° 0

104,864,3

1!1,Î+3,8

97,1+4,8

99>1r5,8

117,4+2,8

119,3+6,5 р с0,01

3 440>21 1,88+0>067

3, 20iO, 18 1, 91+ 0,060

3,02t0,30 1,78t0,15

3,18>0,20 1,99+0,11

3,20>0,20 1 8210,03