Способ получения иммобилизованных люминесцентных бактерий рнотовастеriuм fisснеri штамм 6

 

Изобрет.ение относится к области химии полимеров и биотехнологии и может быть использовано в аналитической химии для определения примем сей органических соединений в растворах Цель изобретения - увеличение длительности использ.ов ания иммобилизованных клеток за счет повышения времени их свечения„ Способ заключается в обработке суспензии клеток морских люминесцентных бактерий Photo- bacterium fisheri штамм 6 привитым сополимером синтетического полимера и хлорангидрида (мет)акриловой кислоты , содержащим 50-170 маСа% привитого олигохлорангидрида с моЛоМ 1000- 1600, из расчета 1 мл суспензии, содержащей 10 - 10 клеток на 1-2 см привитого сополимерао Время свечения целевого продукта составляет 30-40 ч 1 табЛо i СЛ

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (59 4 С 12 N ll/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СОИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4111207/31-13 (22) 13.06.86 (46) 15.05.88. Бюл. II 18 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова и Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева (72) Н,А.Платэ, В.В.Чупов, А.В.усова, Л.И,Валуев, В.С.Данкпов, В.ЯоКабанов и И,А,Часовников (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

1(у 761554, кл. С 12 N 1/20, 1978.

Авторское свидетельство СССР

У 1250571, кл. С 12 N ll/02, 1983. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ Л10МИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ PHOTOBACTERIUM FISHERI ШТАММ 6 (57) Изобретение относится к области химии полимеров и биотехнологии и может быть использовано в аналитической химии для определения приме, сей органических соединений в растворах. Цель изобретения — увеличение длительности использования иммобилизованных клеток sa счет повышения времени их свечения. Способ заключается в обработке суспензии клеток морских люминесцентных бактерий Photobacterium fisheri штамм 6 привитым сополимером синтетического полимера и хлорангидрида (мет) акриловой к-аслоты, содержащим 50-170 мас,X привитого олигохлорангидрида с мол.м, 10001600, из расчета 1 мл суспензии, со6 в и держащей 10 — 10 клеток на 1-2 см привитого сополимера. Время свечения целевого продукта составляет 30-40 е. (/)

1 табл.

1395673

Изобретение относится к химии по,пимеров и биотехнологии, а именно к способу ковалентной иммобилизации клеток, и может быть использовано в технике, в частности для создания

Обладающих повышенным временем действия датчиков для определения различных примесей в растворах, на основе иммобилизованных клеток морских люминес . 10 центных бактерий РЬойоЬасйег1UIQ f1shе

ri (КМПВ), Цель изобретения - увеличение длительйости использования иммобилиэованных клеток за счет повышения времени их свечения.

Способ заключается в ковалентной мо(зйлизации клеток путем обработки

1 их водной суспензии ацилирующим агентом, в качестве клеток используют 20 клетки морских люминесцентных бактерий Photobacterium fisheri штамм 6, в качестве ацилирующего агента— ривитой сополимер синтетического полиера и хлорангидрида (мет)акриловой ислоты, содержащий 50-170 мас„Х привитого олигохлорангидрида с,моекулярной массой 1000-1600, и обраотку суспензии клеток проводят из расчета 1 мл суспензии, содержащий 30

10 — 10 клеток, на 1-2 см поверх6 в 2 ности привитого сополимера.

Получение иммобилизованных клеток (люминесцирующего полимерного материала) проводят в две стадии.

На первой стадии получают привитой сополимер синтетического сополиИера и хлорангидрида (мет)акриловой

Кислоты под действием -облучения йз газовой фазы дозой 2,0-5,0 Мрад. 40

На второй стадии проводят обработКу привитого сополимера водной суспенв в зией клеток с концентрацией 10 -10 клеток/мл суспенэии. Выбор данного интервала концентраций клеточной сус- 45 пензии обусловлен тем, что количество вводимых на поверхность клеток (и, как следствие, интенсивность люминесценции материала) не изменяется при более высокой их концентрации в суспензии, при концентрации суспенэии клеток менее 10 клеток/ип не достив гается насыщения поверхности привитого сополимера иммобилизируемыми клетками.

Обработку .привитого сополимера суспензией КМПБ проводят путем погружения привитого материала в суспензию клеток в 0,05 М фосфатном буфере„ содержащем 0,3 М хлорида натрия (рН 7,8) при 0-4 С Hà 16-20 ч из . расчета 1 мл суспензии клеток на 12 см привитого сополимера, так, чтобы вся его поверхность была погруже" на в суспензию клеток, В качестве исходных полимеров возможно использование следующих классов полимеров. полиолефинов, полиэфиров, полиамидов, полиакрилатов и.пр.

При этом может быть использована любая форма полимеров: пленки, волокна, гранулы, сложнопрофильные иэделия иэ блоков полимеров, порошки.

Способ позволяет увеличить длительность использования иммобнлизованных клеток за счет повышения времени их свечения до 30-40 ч (вместо 8 ч для интактных клеток и менее часа для иммобилизованных известным способом) °

Пример 1. Обезжиренную этанолом пленку иэ полиэтилена (ПЭ) площадью 100 см помещают в специаль2. ную ампулу с перетяжкой, в нижнюю часть которой заливают 1 мл хлорангидрида метакрнловой кислоты (МАХ) так, чтобы жидкость не соприкасалась с полимером. Ампулу вакуумируют до остаточного давления 10 торр, запаивают и облучают 2I -излучением (источник излучения Со, установка бо типа ГУРХ)мощностью дозы 0,5 Мрад/ч до общей дозы 2,5 Мрад. Во время облучения нижнюю часть ампулы экранируют свинцовой защитой для предотвращения гомополимеризации хлорангидрида, После облучения ампулу вскрывают, пленку промывают абсолютированным эфиром для удаления непрореагировавшего хпорангидрида и высушивают. Коли. чество привитого MAX со средней длиной цепи 16 мономерных звеньев (молекулярной массой l600)составляет 4,40"

«10 г/см поверхности пленки.

Привитой сополимер инкубируют в течение 20 ч при 4 С в суспензии

КМЛБ Photobacterium fisheri штамм 6 в 0,05 М фосфатном буфере, содержащем 0,3 М хлорица натрия (рН 7,8), концентрацией 10 клеток/мл суспен в зии. На 1 см привитой пленки берут

1 мл суспензии клеток так, чтобы вся поверхность пленки была покрыта жидкостью, Привитую пленку после иммобилизации промывают 0,05 М фосфатным буфе73 з 13956 ром, также содержащим 0,3 М хлорида натрия (рН 7,8), до прекращения свечения промывных вод, определяемого на фотометре по интенсивности люми5 несценции неиммобилизованных смытых клеток, помещают в термостатирована ную ячейку (24 С) с постоянным перемешиванием и измеряют интенсивность люминесценции на фотометре с ФЭУ, откалиброванном в области длин волн

480-500 нм. Время, за которое интенсивность люминесценции уменьшается на 507. (время свечения люминесцирующего материала), составляет 38 ч, Время 15 свечения контрольной суспензии интактных клеток в тех же условиях - 8 ч.

Пример ы 2-8. Все операции осуществляют аналогично примеру 1.

Данные опытов по примерам приве- 20 дены в таблице.

Пример 9. ПЭ-пленку, не подвергнутую привитой сополимеризации с

МАХ, выдерживают 20 ч при 4 С в суспензии КМЛБ (условия аналогичны примеру 1) и определяют время свечения сорбированных клеток. Время свечения составляет 9 ч, после чего практически все иммобилизованные нековалентно (сорбированные) клетки вымы- 30 лись с поверхности полимерного материала, Пример 10(сравнительный по прототипу). К суспенэии 10 мл КМЛБ в 0,05 М фосфатном буфере, содержащем З5

0,03 М хлорида натрия (рН 7,8) содержащей 108 клеток/мл, добавляют при постоянном перемешивании при

4 С 100 мкл (0,01 г) NAX, доводят смесь до комнатной температуры, до- 40 бавляют 1 г АА, 0,1 r БИС и полимеризуют под действием системы персульфат калия — метабисульфит калия в течение 1 ч. Получают гель с ковалентно иммобилизованными клетками 45

KNJIB в виде пленки. Интенсивность люминесценции полимерного материала с ковалентно иммобилизованными данным способом КМЛБ составляет О. Препарат не обладает свойствами люминесцирую- 50 щего полимерного материала, поэтому время свечения его определить невозможно.

Пример 11. Пленку с иммобилизованными КМЛБ помещают в термостатиО рованную ячейку (температура 24 С) и к фосфатному буферу добавляют

10 моль диоксана. Интенсивность люминесценции пленки мгновенно падает до О.

Пример 1?. Все операции проводят как в примере 11, добавляя 10 мас.X акриламида. Интенсивность люминесценции мгновенно падает до О.

Пример 13, Все операции проводят как в примере 1, используя суспензию клеток, содержащую 10 млн. клеток/мл, взятую в количестве 50 мл на общую площадь пленки 100 см, что

z составляет 1 мл суспензии на 2 см поверхности пленки. Пленка содержит г

4,40 г привитого олигомера на 1 см (или 8,80 г на 2 см ) ° Время жизни клеток 39 ч.

Пример 14. Все операции проводят как в примере 1, используя суспензию, содержащую 10 млн. клеток/мл, в количестве 50 мл на 100 см поверхz ности (или 1 мп на 2 см ). Время жизни клеток 32 ч.

Пример 15 (контрольный). Все операции проводят как в примере 1, используя 4 мл суспензии клеток с

6 содержанием клеток 10 млн/мл на

2 см поверхности пленки. Время жизг ни клеток составляет 40 ч, т. е, не увеличивается при увеличении соотношения объем суспензии клеток: 12 см поверхности.

Пример 16 (контрольный). Все операции аналогичны операциям примера

1, но используют суспенэию с концент5 2 рацией 10 млн. клеток/ 2 см поверхности в количестве 1 мл. Время свечения клеток 12 ч.

Пример 17 (контрольный).

Все операции проводят как в примере

1, используя соотношение 0,5 мл суспензии с концентрацией 10 млн/мл на 1 см поверхности. Время свечения г

40 ч, т.е. увеличение концентрации

8 суспензии выше 10 млн клеток/мп не приводит к увеличению времени жизни.

Среднее значение площади поверхности пленок изменяется в пределах

2 ° от 1 до 100 см ; большие площади не удается поместить в установку для облучения типа ГУРХ. Площадь поверхности порошка полиамида в примере 6—

10 см /г.

Пример 18. К 1 мл суспенэии б с содержанием интактных клеток 10 на 1 мл добавляют водный раствор иэопропанола и регистрируют изменение

1395673

1 е, Объем Кол-во

Время свечеа р, форма Хлор ан гид рид насые!енн

Примечание оленна став привитого сополимера суспен- клеток эии на l см лярния иммобилимас. Х елей лигоклесуспенэии приитого асса ривиого ток иа

1 см привитого олигохпорангидрида эоваиных привито- клеток, го по- ч лигоера а1см

osepxости, 10 поверхности оргидлимера привитого полимера! Полиэтилен, пленка NAX!

600 1,0 10

Фиэико-меха38!

2,5 4,40

50 нические свойства ис2 Попивтилентерефталат, пленка АХ кодных полимеров и модифицированных практически один акое ы

1100 1)0 1О

)3

З„О 4,93

3 Полнпропипен, волокно МАХ!

ООО 1,О 1От

130 зо

5,0 5,94! о

4 Па!!лон-6,6-, волокно NAX

1400 0,5 10

1500 0,5 1О

3,0 5 02.

5 Полидиме тнлсилок сан > АХ

2,5 4,26

40 б Полиамил, граиулы диаметром 0,1 мм AX

10 40!

500 0,5

2,5 4,43 интенсивности свечения клеток в эав33симости от концентрации спирта, Полное тушение люминесценции наблюдается при конечной концентрации ингибитора (1,9-0,!) 10 моль/л.

-Ф 5

Пример 19. 1 см пленки (полуб ченной по примеру 3), содержащей 10 иммобилизованных клеток, помещают в раствор, содержащий изопропанол и 10 регистрируют свечение пленки в эависнмости от концентрации спирта. Полное тушение люминесценции наблюдается при конической концентрации ингибит эра (2,1+0,1) 10 моль/л. Аналогич- 15 н!3й чувствительностью обладают клетк 3, полученные по примерам 1-2, 4-8, с33едовательно, чувствительность интактных и ковалентно иммобилизованных кл1 еток к гидрофобным молекулам прак- 20 тически одинакова. жоаким образом, как нативные, так и иммобилизованные клетки оказываются одинаково чувствительными к гидрофоб- 25 и ам соединениям.

Выход обладающих люминесцендий клеток при иммобилизации предложенным способом составляет бО-70% от их исходного количества, что определяется 30 подсчетом клеток в исходной и конечнрй суспензиях.

Таким образом,.изобретение позволяе г получить люминесцирующие полимерные материалы с ковалентно иммобилизованным КМЛБ, обладающие функциональной активностью и повышенным временем свечения клеток (до 30-40 ч), целевой продукт может быть испольэо" ван дпя индикации органических примесей в растворах. формулаиэобретения

Способ получения иммобилиэованных люминесцентных бактерий РЬосоЬас егдu3!3 fischeri штамм 6, включающий обработку водной суспензии бактерий органическим ацилирующим реагентом, проведение иммобилизации с использованием органического полимера, отделение полученных клеток от реакционной смеси, отличающийся тем, что, с целью увеличения длительности использования иммобилизованных клеток за счет повьппения времени их свечения, иммобилизацию про" водят путем обработки ацилирующим реагентом, в качестве которого используют привитой сополимер синтетического полимера и хлорангидрида (мет)акриловой кислоты, содержащий

50 — 170 мас.7 по массе привитого олигохлорангидрида с мол.м, 1000—

1600 дальтон, причем обработку суспенэии клеток проводят иэ расчета

1 мл суспенэии, содержащей от 10 до 10 клеток на 1-2 см поверхности

8 2 привитого сополимера.

1395673

Прололжс. ние таблицы о Время

НолеСостав привитого сополимера пимер,фор оргидсвечехулярная иия нммобилиид не асыеиной

ac.l масса г привитого привитого эованных хлеток, ч ого олигоислокларан гидрида лигохлоран гидрида

10Ь

1800 2, 5

2,0 2,93 25

6,0 7,33 200

ip3

10 8

9 Сравнит елъный

Полиэтилен э пленка

Напал эффехтивность имизбнпнз алии.

° а н»

Деструкция полимера.

Полная десорбдия хлетох ss 9 ч

Составитель В,Муроиец

Техред Л.Сердюкова

Редактор Т.Лазоренко

Корректор М.Помо

Заказ 2468/27 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1 Полиэтилен, пленха (контролънэа1) НАХ

8 Полиэтилен, пленка (контролънэа1) НАХ

Доза облучения

Мрад мера ил 1 см пове рхности 10 пеней олнгохлорангнд рида

890 1,0

0 1,0

12Н

91» 1е С