Способ получения гетерогенного биокатализатора

 

Сеюз Советских

Сециалиатмчесммх

Фее убл

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (и)906602 (61) Дополнительное к авт. свнд-ву « (22) Заявлено 30.04.80 (21) 2923592/23-04 (5! )М. Кл.

В 01 J 37/04

В 01 Ю 37/36

В 01 Z 31/06

G 12 N 11/08 с присоединением заявки М

Ьеудеретеенвмй кемнтет

СССР

Ilo девам нэебретеннй н вткрытнй (23) ПриоритетОпубликовано 23.02.82, Бюллетень No 7

Дата опубликования описания 23.02.82 (5D) Уд К 66.097..3 (088.8) (72) Авторы изобретения

А. Д. Вир ник, H. Р. Кнльдеева, Л. С. Слобщщ.никава

В.К. Латов и B.Ì. Беликов а.. в . ..

ыл Л . к

Московский ордена Трудового Красного, Зйймрцщ;ы:."в.. :„. " текстильный институт и Ордена Ленина !инстидт,„ ... элементорганических соединений АН СССР (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА в вакууме 2).

Изобретение относится к биотехнологии, и частности к способам получения гетерогенных биокатализаторов — фермен- тов, иммобипизованных в нераствори мых матрипах, которые могут найти широкое применение в химической, медицинс

5 кой, ттишевой и микробиологической промышленностях

Известен способ получения гетерогенHbI 6HOKBTBJIK3BT0pOB - иммобилизован

10 ных ферментов, путем присоединения протеолитических ферментов к полимерам ковалентными, ионными и координапионными связями|1 1.

Однако при этом не достигается доста-, точно высокой стабильности гетерогенного биокатализатора.

Наиболее близким по технической сущ.ности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения гетерогенного биокатализатора для гидролтвза пептидов в растворе cL -аминокислот путем растворения Протосубтилина в водном растворе фосфатного буфера сополтемера стирола и малеиновой кислоты с последуюшим добавлением водного рас вора хлорида хрома (Ш), промыванием образовавшегося хромсодержащего комплекса Протосубтилина с сополимером стирола и малеиновой кислоты и сушкой его

Недостатком этого способа является невысокая стабильность гетерогенного биокатализатора к действию раствора смеси сх.-аминокислот, которые являются конкурентными лнгандами и способны разрушать металлосодержаший комплекс фермента с сополимером стирола и малеи новой кислоты. При контакте с раствором сЧ -аминокислот уменьшается ферментативная активность нммобилизованного фермента и в раствор с{-аминокислот с носителя десорбируется фермент, это приводит к уменьшению срока службы гетерогенного биокатализатора (5 сут) и загрязнению получаемого целевого продук- та десорбирукмпим с носителя ферментом

90660 (20% от содержания белка в биокатализаторв).

Цель изобретения — получение биокатализатора с повышенной стабильностью.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения гетерогенного биокатализатора для гидролиза пептидов путем растворения: Протосубтилина в водном растворе фосфатного буфера сополимера стирола и малеиновой кисло- 10 ты с последукхцим добавлением водного раствора хлорида хрома (l!I), промыванием образовавшегося хромсодержашего комплекса Протосубтилина с .сополимером стирола и малеиновой кислоты, высу- 5 шенный хромсодержаший комплекс суспендируют в ацетоновом растворе фторопла та и формуют пленку или волокно, Преимушество предлагаемого изобретения заключается в получении биокатали 2р затора с повышенной стабильностью. В процессе его эксплуатации активность в реакции гидролиза пептидов в растворе

Д. -аминокислот при нагреве при 37 С в фосфатном буфере рН=7,4 и модуле ван-д ны 200 составляет по истечении 15 сут

60% от исходной, тогда как биокатализатор по известному способу на седьмые сутки полностью утрачивает свою активность. 30

Высокая активность катализатора по предлагаемому изобретению сопровождается высокой стабильностью хромсодержащего комплекса в водном растворе с(. -аминокислот. Так, количество белка, десорбиро 35 вавшегося в 5%-ный раствор смеси о .-аминокислот составляет только 2% от содержания белка в биокатализаторе (для биокатализатора по известному способу (2 — 20%) .

Пример1. В140мл2%-ного раствора сополимера стирола и малеиновой кислоты в 0,25 М фосфатном буфере растворяют при комнатной температуре

3 r Протосубтилина. После растворения добавляют водный раствор хлористого хрома (ill) в количестве, обеспечиваклцем образование 1 М раствора. Образовавшийся осадок тщательно промывают водой и высушивают в вакууме при комнат ной температуре.

К 100 мл 14%-ного раствора фторс -. пласта 42 в ацетоне при перемешивании (600 об/мин) прибавляют 1,106 r высушенного и размолотого (размер частиц

50-100 мкм) хромсодержашего комплекса Протосубтилина ГЗХ (Сг -1 вес. ) ,с сополимером стирола и малеиновой кислоты, полученного ло известному спо2 собу. Полученную суспензию перемешивают еше 30 мин и формуют пленки по сухому способу. Зффективность иммобилизации — 21 . Фермент не десорбируется при промывках 0,2 М фосфатным буфером рН 7,4.)

Пример 2. К 100 мл 14-ного раствора фторопласта-42 в ацетоне при перемешивании (600 об/мин) прибавляют .0,553 r лиофильно высушенного и размолотого хромсодержашего комплекса Протосубтилина ГЗХ (С " 1 вес. ) с сополимером стирола и малеиновой кислоты, полученного по описанному в прймере 1 способу. Полученную суспензию перемешивают 30 мин, обезвоздушивают в течение 1 ч и формуют волокно в водно-ацетоновую ванну (соотношение ацетонвода 95:5). Волокно вытягивают на воздухе в два раза, высушивают и затем вытягивают на 500 в глицерине при о

140 С. Полученное волокно промывают от глицерина водой и сушат. Эффективность иммобилизации составляет 40%.

Была изучена стабильность исходного хромсодержащего комплекса протеолитического фермента с сополимером стирола и малеиновой кислоты и биокатализаторов, полученных по предлагаемому способу, к:действию 5%-ного par- a смеси 18 Йаминокислот эквимолекулярные количества аланина, глицина, серина, треонина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, пролина, валина, метионина, цистеина,лейлина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, гистидина, лизина и о аргинина) при4 С и модуле ванны 40 (впересчете на иммобилизованный фермент).

При этом определялосы изменение активности обоих гетерогенных биокатализато ров и десорбция из них белка (табл. 1 и 2). Была изучена также термостабильность указанных биокатализаторов (табл. 3) при 37 С и рН=7,4 (0,2 М фосфатный буфер, модуль ванны 200).

Полученные по предлагаемому способу биокатализаторы в отличие от исходных металлосодержаших комплексов протеологического фермента с сополи мером стирола и маленковой кислоты могут быть использованы не только в аппаратах с перемешиванием периодического действия, но и в аппаратах колоночного типа.

Биокатализатор испытывался на установке проточного типа и показал стабильную активность для полного гилролиза пептидов в растворе смеси c(-аминокислот в течение 10 дней.

906602

:Таблица1

Известный

0

Предлагаемый

72

60

61 Т а б л и ц а 2

20

16,3

19,2

9,7

Известный

Предлагаемый

1,5

95

Известный

Предлагаемый

100

100

84

Формула изобретения

Способ получения гетерогенного биэкатализатора для гидролиза пептидов путем растворения Протосубтилина в водном растворе фосфатного буфера сополимера стирола и малеиновой кислоты с последующим добавлением водного раствора хлорида хрома .(111), промыванием об- 50 разовавшегося хромсодержашего комплекса Протосубтилина с сополимером стирола и малеиновой кислоты и его сушкойввакууме, отлича юшийся, тем, что, с целью получения биокатали- зЗ затор с повышенной стабильностью, высушенный хромсодержаший комплекс сус1 пендируют в ацетоновом,растворе фторопласта и формуют пленку или волокно.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Иммобилиэованные ферменты.

Под ред. Березина И.В., Антонова В.К. и Мартинека К. МГУ, 1976, т. 1, с. 118

2. Слободяникова Л.С., Латов В.К. и Беликов В.М. Иммобилизация протеаз

BQC1(BUG +4t1615 на сополимере стирола с малеиновым ангидридом ковалент ными и координационными связями.

Прикладная биохимия и микробиология"., 1979, т. 15, с. 262 (прототип).