Способ получения водорастворимой иммобилизованной холинэстеразы

 

Союз Советскии

Социалистичвские

Республик

ОПИСАНИЕ

И ЗОВРЕТЕ Н Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

«i>907071 (6I ) Дополнительное к авт. свид-ву— (22)Заявлено 20.06.80 (21) 2944034/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 23. 02. 82. бюллетень Ме 7

Дата опубликования описания 23.02,82 (5l)M. Кл.

С 12 N 11/08 (Ъеударотееииый комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15 (088.8) с !

Л. В. Айзенберг, Н.Н. Усачева, Е. В. Кошкар в и т !

1 !

А.П.Савельев

1 (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54.) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИИОЙ

ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

Изобретение относится к получению биологически активных веществ, а именно к способам получения водорастворимых иммобилизованных ферментов, и может быть использовано для получения препаратов, применяемых для проведения кинетических, аналитических определений, и в частности, для количественного измерения концентрации ингибиторов фермента.

Известен способ получения водорастворимых производныхс! -химотрипсина на карбоксилсодержащих растворимых в воде полимерах (полиакриловой кислоте, карбоксиметилцеллюлозе и полит .-глутаминовой кислоте) . В качестве сшиваощего агента используется реактив Вудворта, представляющий собой M-этил-5-фенилизоксозолий-3-сулъфонат. Активность иммобилизозанного фермента составляет !7-94% от первоначальной активности нативного ! j.

Известен также способ получения водорастворимой иммобилизованной холинэстеразы (КФ 3.1.1.8), в котором иммобилизацию фермента проводят на полигалактуроновой кислоте, поли-g-аспарагиновой кислоте или поли-1,-аланине, смешанном с поли-ь-глутаминовой кислотой, с помощью реактива Вудворта. Полученные водорастворимые препараты фермен10 та имеют активность, составляющую

42-48Х от активности нативного фермента. Стабильность препарата не исследована (23.

К недостаткам известного спосо IS ба следует отнести необходимость применения специального сшивающего реактива и то, что процесс иммобилизации протекает при низких температурах. Это является нежелательным, так как при последующей работе

° с таким ферментным препаратом при температуре выше 20 С могут происходить дополнительные вэаимодей7О7 1 4

3 90 ствия остаточного реактива с ферментом.

При ик юбилиэации по известным способам фермент неполностью связывается и частично ингибируется.

При использовании водорастворимых иммобилизованных ферментов для анализа и особенно в автоматизированных приборах, важным свойством таких ферментов является стабильность их растворов при инкубации о при температуре 38-40 С.

Цель изобретения — повышение активности и стабильности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения водорастворимой иммобилизованной холинэстеразы в качестве полимера используют полидиацетонакриламид в концентрации О,l-i а иммобилизацию проводят при температуре 40-50 С.

Иммобилизация фермента на носителе осуществляется за счет образо вания ковалентных связей свободных аминогрупп холинэстеразы с карбониль-. ными группами водорастворимого полидиацетонакриламида.

Приготовление раствора водорастворимого полимера диацетонакриламида осуществляют путем свободнорафикальной полимеризации мономера в водной фазе в присутствии водорастворимого инициатора — персульфата аммония.

Для этого в стеклянный реактив, снабженный обратным холодильником, мешалкой, термометром, помещают 18 мл дистиллированной воды, 2 г диацетонакриламида растворяют в 40 мл дистиллированной воды, 0,01 г персульфата аммония растворяют в 40 мл дистил" лированной воды. Растворы ДАА и ПА дозируют их в течение 1 ч при 50 С . о

Необходимую температуру поддерживают с помощью водяной бани с регулируемым подогревом. Температуру повышают до 70 С и проводят выдержку о в течение З,ч.

t0

1S

3S

Ю

4$

Полученный раствор полидиацетонакриламида применяют для иммобилизации холинэстеразы.

II р и м е р 1. Берут 0,7 мл раствора полиацетонакриламида, доводят дистиллированной водой до 10 мл.

В этот раствор вносят 80 мг холинэстеразы активностью 1 ОЕ, тщательно перемешивая, термостатируют при . о, температуре 40 С в течение 3 ч. Затем охлаждают до комнатной температуры.

Иммобилизация проходит без потери активности. Иммобилизованный фермент сохраняет на 95% свою активность в течение 18 сут при 35-38 С. Неиммобилизованный фермент в таких же ус" ловиях на 20 . теряет активность в течение 1, 5 сут, а эа 5 сут — íà 50Х.

Пример 2. 7 мл полученного раствора полиднацетонакриламида доводят до 10 мл дистиллированной водой и растворяют в нем 800 мг холинэстеразы с активностью 10 E. о

Иммобилизацию проводят при 50 С в течение 1, 5 ч.

Иммобилизованный фермент сохраняет свою активность на 100 . В водных растворах при 35 С в течение 20 сут о наблюдается потеря активности лишь на 5 .

Использование предлагаемого способа иммобилизации позволяет получить водорастворимые препараты холинэстеразы с полным сохранением первоначальной активности фермента, тогда как активность холинэстеразы, иммобилизованной известным способом, приводит к двухкратному снижению активности.

При хранении иммобилизованного предложенным способом фермента в течение 18-20 сут при 35-38 С активность его снижается только на 51, тогда как активный фермент при указанной температуре инактивируется на 20 и 50 за 1 и 5 сут, соответственно.

Использование иммобилизованной на полидиацетонакриламиде холинэстеразы при определении концентрации ингибиторов фермента позволит увеличить сроки хранения готовых водных растворов фермента в 5-10 раз, а также даст воэможность повысить производительность и эффективность аналитического определения путем применения готовых ампулированных растворов фермента с повышенной стабильностью при хранении по сравнению с применяемыми сухими препаратами холииэстеразы.

Водные растворы стабилизированной при помощи иммобилизации холинэсте" разы могут найти широкое применение в медицине, сельском хозяйстве и дру гих отраслях народного хозяйства при определении физиологической активности веществ - ингибиторов холинэстеразы.

5 907071 6

Таким образом, реализация изобре- шийся тем, что, с целью повышетения позволяет получить водораст- ния активности и стабильности целеворимые препараты холинэстеразы с вого продукта, в качестве полимера повышенной активностью и стабильнос, используют полидиацетонакриламид тью. 5 концентрации О, 1-1Х, а иммобилизацию проводят при 40-50 С.

Формула изобретения

Составитель В.Муронец

Редактор Г.Волкова Техред М. Тепер Корректор Л.Бокшан

Заказ 519/34 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения в дорастворимой иммооилизованной холинэстераэы путем путем иммобилизации на растворимых в воде полимерах, о т л и ч а ю— !

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Иммобилиэованные ферменты. Под ред. И.В.Березина и др. М., Изд-во

МГУ,. 1976, т. 1, с. 218-219.

2. То же, т. 2, с. 276 (прототип).