Способ получения иммобилизованной монофенол-монооксигеназы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ МОНОФЕНОЛ-МОНООКСИГЕНАЗЫ путем обработки органического носителя раствором, содержащим монофенол-монооксигенаэу , отличающийся тем, что, с целью сохранения активности фермента при иммобилизации и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качестве раствора, содержащего фермент, используют культуральный фильтрат базидиапьного гриба Coriolus hirsutus. (Л

СОЮЗ GOBETCHMX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

3(50 С 12 1 08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ QCCP

ПО 4ЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 3464475/28-13 (22 ) 07 ° 07.82 (46 ) 30. 01. 84. Вюл. Р 4 (72) A.Á. Емец, В.П. Гаврилова, Н.А-.. Гончарова, t0 Е.. Казакевич, Н.И. Свердлова, Н.К. Григорьева, Л.Н. Федорова и Л.A. Вольф (71) Ленинградский ордена Трудового

Красного Знамени институт текстильной и легкой промышленности им. С.М. Кирова и Ботанический институт им. В.Л. Комарова (53) 577.15(088.8) (56 ) 1. Патент СИА Р 3897308, кл. С 07 с 7/02, 1975 °

2. Stene J, V. Townshend А.

Determination of traces of соррег . by activation of water-insoluble

apopolyphenol oxidase. J. of the

Chemical Society Dalton Transact.

1973, ч.5, р.р. 495-501

„Л0„„10701 A (54 ) (5 7 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ МОНОФЕНОЛ-МОНООКСИГЕНАЗЦ путем обработки органического носителя раствором, содержащим монофенол-монооксигеназу, отличающийся тем, что, с целью сохранения активности фермента при иммобилизации и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качест. ве раствора, содержащего фермент, используют культуральный фильтрат базидиального гриба corio) us hirsutus.

1070164

Изобретение относится к получению иммобилизованных ферментов, в частности полифенолмонофенол-монооксигеназы (полифенолоксидазы), которая может быть использована как катализатор со специфической и контролируемой активностью s химической промышленности и в производстве дубильных веществ, а также в прикладной биохимии и микробиологии.

Известен способ иммобилизации про- 10 мааленной грибной монофенол-моноокси.Ф. гЕназы в жидких мембранах (11 „

Недостатками способа являются слож,ность получения жидких мембран, их нестабильность, а также невозможность!5 многократного использования иммобилизованного эакапоулированного фермента в. технологическом цикле иэ-за малой механической устойчивости эмульсий кммобклизованных ферментов. 20

Наиболее близким по технической сущности и.достигаемому результату к предлагаемому является способ получения имаобилизованной монофенолмоиооксигенаэы путем обработки органи.у5 ческого носителя (энзакрил AA) раствором, содержащим монофенол-монооксигеназу. Способ заключается в ковалентной ивмобилизации фермента на органическом носителе (энэакриле AA) с помощью реакции азосочетания t2 1.

Недостатками известного способа являются низкая удельная активность целевого продукта (25% от активности растворимого) и длительность иммобилизации (65 ч).

Цель изобретения - сохранение активностк фермента при иммобилизации и упрощения. процесса.

Поставленная цель достигается 40 .тем, что согласно способу получения иммобилизованной монофенол-монооксигеназы путем обработки органического носителя раствором, содержащим монофенол-монооксигенаэу,. в качестве 45 носителя,используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качестве раствора, содержащего фермент, используют.культуральный фильтрат баэидиального гриба Coriolus hirsutus.

Предлагаемый способ позволяет ис, пользовать полифенолоксидазы, продуцируемые базидиальным грибом СО1155 цию из неочищенных культуральных фильтратов, что обеспечивает возможность исключить стадии осаждения, фильтрации и очистки фермента и таким образом испольэовать для иммобилизации более дешевый и доступный продукт.

Иммобилкэованная на волокнистом носителе полкфенолоксилаза является биологически активным гетерогенным катализатором, что, во-первых, поз- 65 воляет использовать иммобилиэованную полифенолоксидазу многократно, так как легко осуществить отделение волокна от растворимых продуктов реакции и субстрата, а во-вторых, обеспечивает воэможность перевода периодических технологических процессов на непрерывный режим.

Кроме того, .способ кммобилизации отличается простотой и высоким качеством получаемого продукта (выход по активности достигает 85-96%), Способ осуществляют следующим образом.

Фермент полифенолоксидазу получают выращиванием баэидиального гри3 . ба Coriolis hirsutus. поверхностным способом на питательной среде, содержащей, r: глюкоза 10, пептон 3, KHgPOq 0,6, KgHPOq 0,4, MpSOq- TH O

0,5 и CuSO„ 50 мг, FeSO 7Н О 5 мг и 2 л водойроводной воды. Продолжительность выращивания гриба составляет 10 сут при 24-26 С, Данный штамм синтезирует внеклеточную полифенолоксидазу, активность которой составялет 1,48-5,23 ед/мг белка. Активность определяют по -окислению пирокатехина к парафенилендиамкна.

Для иммобилизации навеску аминосодержащего полйакрилонитрильного волокна обрабатывают в течение

30-60 мин культуральным фильтратом, полученным в результате выращивания гриба Coriolis nirsutus . По оконча .нии обработки продукт промывают дис-. тиллированной водой.

Пример 1. Амкносодержащее полиакрнлонитркльное волокно.(0,5 r) обменной емкостью 2 ммоль/г обрабатывают в течение 30 мин при 18 С

50 ми культурального фильтрата баэидиального гриба Coriolis hirsutus с активностью 1,48 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой.

Получают препарат с активностью

4,17-ед/г волокна (90% от исходной).

Пример 2, Амнносодержащее полиайрилонитрильное волокно 0,5 r емкостью 2,5 ммоль/г обрабатывают в течение 45 мин прн 20 С 50 мл культурального фильтрата баэидиального гриба Coriolus hirsutus o aKTHBHOcTblo

4,13 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой. Получают пре- . парат с активностью 25,9 ед/г волокна (85% от исходной).

Пример 3. Аминосодержащее полкакрнлонктрильное волокно 0,5 r с емкостью 3 ммоль/г обрабатывают в течение 60 мин при 22 С 50 мл культурального фильтрата базидиального гриба Coriolus hirsutus с активностью.

5,23 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой. Получают препарат с активностью 40 ед/г волокна (80% от исходной).

1070164

35

Составитель В. уронец редактор А. Курах Техред Л.иартяшова Корректор Л. Патай Заказ 11643/27 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

При иммобилизации фермента проис-. ходит образование стабильного комплекса ферме .т-волокно, что подтверждается устойчивостью связи между носителем и ферментом, которая не разрывается в ацетатном и фосфатном буфере с различной ионной силой и рН. Наиболее вероятно, что связь белка с носителем осуществляется в данном случае по механизму координационно-ионной иммобилизации с образо- 10 ванием комплекса металлосодержащий фермент - аминосодержащая хелатообразующая группировка волокнистого носителя.

Стабильность комплекса фермент - 15 волокно оценивается в конкретных технологических процессах, в частности при окислении о-дефенолов.

Полученные образцы иммобилизованного Фермента на аминосодержащем во- 20 локне имеют высокую стабильность, позволяющую использовать их многократно.

За 7 циклов использования актив- 25 ность снижается только на ЗОВ. Иммобилиэованный фермент обладает более высокой термостабильностью, чем растворимый.

Определение активности проводят ,по методу, основанному на измерении активности Фермента по скорости образования сине-фиолетовой окраски окис ленного диметил-и-фенилендиамина в присутствии пирокатехина. Активность A вычисляют по найденной ско-. рости реакции по формуле

Е(а а Ь) с. С где Е» экстинкция (0,200), а - отношение количества жидкости, взятой для приготовления вытяжки степень дополнительного разведения вытяжки, \ степень постоянного. разведения вытяжки в реакционной смеси, с - толщина слоя (2 см); время (в секундах).

При иммобилизации монофепил-монооксигенаэы в условиях, параметры которых находятся ниже укаэанных пределов, не достигается удовлетворительных результатов по активности имиобилизованной на волокне полифенолоксидазы. Превышение этих условий не обеспечивает роста активности фермента на волокне и является неэкономичным. Использование в качестве носителя аминосодержащего полиакрилонитрильного волокна емкостью менее 2 ммоль/г не обеспечивает полного извлечения фермента из культуральнаго фильтрата, а применение волокна емкостью выше 3 ммоль/г .нецелесообразно, поскольку при этом не наблюдается роста активности иммобилизованного фермента.

Иммобилизация фермента на волокнистом носителе непосредственно из культурального фильтрата,базидиальных грибов экономически нецелесообразна, во-первых, из-за исключения таких стадий выделения и очистки фермента, как осаждение и фильтрация.

Во-вторых, стоимость культурального фильтрата невелика по сравнению с чистым ферментом и составляет около

30 руб/т. Иммобилизация непосредственно иэ культурального фильтрата позволяет снизить расход на получение фермента в 200 раэ. Активность иммобилизованной на волокне полифенолоксидаэы составляет 80-90% от Исходной, что на 55-65% выше по сравнению с известным способом. Эти свойства позволяют рекомендовать ферментсодержащие волокна в качестве биокатализатора, волокнистая форма которого облегчает возможность проведения ферментативных реакций по непрерывной схеме.