Способ получения убихинонов

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения убихинонов. С целью повышения выхода убихинонов в качестве микроорганизмов продуцентов используют фототрофные бактерии: для получения убихинона Q₇ штамм Ectothiorhodospira Shaposhnikovii ММК В 1525, убихинона Q₈ штамм Thiocapsa roseopersicina ВКМ В 1613, убихинона Q₁₀ - штамм Rhodobacter cap sulatus ВКМ В 1614. Биомассу бактерий омыляют и выделяют убихиноны из неомыленной фракции.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения убихинонов. Цель изобретения повышение выхода убихинонов. Способ осуществляют следующим образом. В качестве микроорганизмов продуцентов убихинонов используют фототрофные микроорганизмы, которые выращивают периодическим или непрерывным способом в оптимальных для роста условиях. Биомассу из культуральной жидкости выделяют сепарированием и используют для выделения убихинонов. Выделение убихинонов проводят в несколько стадий. Вначале липиды клеток омыляют спиртовым раствором едкого кали в присутствии пирогаллола при кипячении в атмосфере аргона. Затем проводят экстракцию убихинона из неомыленной фракции петролейным эфиром, гептаном или гексаном. Экстракт промывают водой, сушат сульфатом натрия и упаривают досуха в вакуумном испарителе. Смесь убихинона и неомыленных липидов разделяют с помощью адсорбционной хроматографии на колонке с окисью алюминия. Убихинон выделяют кристаллизацией из абсолютного этанола. Для получения хроматографически чистого продукта проводят дополнительную очистку убихинонов в системе петролейный эфир диэтиловый эфир ледяная уксусная кислота (90:30:1). Идентификацию полученного убихинона проводят с помощью метода жидкостной хроматографии при высоком давлении на хроматографе фирмы "Beckman" и колонке "Altex Ultrasphere ODS 5" (4-6 мм х 25 см) в системе изопропанол метанол 50: 50 (объем/объем) при 270 нм, используя соответствующие маркеры убихинонов Q₆ Q₁₀. Выход убихинонов 2,2-4,3 мг на 1 г сухих клеток. Выход убихинонов по известному способу 0,2 мг/г. П р и м е р 1. Фототрофные бактерии Rhodobacter capsulatus ВКМ В-1614 выращивают в тонком слое при освещенности 100 ВТ/м² в аппарате для непрерывного культивирования микроорганизмов, управляемом микроЭВМ. Установка предназначена для контролируемого непрерывного культивирования чистых культур фототрофных микроорганизмов в целях поддержания оптимальных условий их роста, а также получения биомассы с высоким содержанием практически важных соединений. При помощи созданного программного обеспечения осуществляют контроль и регулирование таких параметров роста культур, как температура, рН, Eh, скорость подачи среды и титрантов в ферментеры, оптическая плотность суспензии микроорганизмов, содержание подаваемых и образуемых газов (азот, водород, двуокись углерода, кислород). Культивирование ведут при 30^оС на среде Ормерода, которая имеет следующий состав, (NH₄)₂SO₄ 0,125 KH₂PO₄ 0,09 K₂HPO₄ 0,06 MgSO₄ ˙7H₂O 0,02 CaCl₂ ˙6H₂O 0,0075 FeSO₄ ˙7H₂O 0,001 ЭДТА 0,002 Микроэлементы, мл/л 1 Состав микроэлементов, мг/100 мл: H₃BO₃ 280 Na₂MoO₄ 75 MnCl₂ ˙4H₂O 290 ZnSO₄ ˙7H₂O 24 CuSO₄ ˙5H₂O 55 В среду вносят также 0,2% лактата натрия в качестве источника углерода и 0,01% дрожжевого экстракта, рН среды 6,8. Полученную биомассу отделяют от культуральной жидкости с помощью сепаратора и лиофильно высушивают. Затем проводят омыление липидов следующим образом. 1 г сухих клеток помещают в колбу с мешалкой, приливают 10 мл воды, 0,5 г пирогаллола в 15 мл этанола и 5 мл 25%-ного раствора КОН. Смесь кипятят с обратным шариковым холодильником в течение 25 мин при перемешивании в токе аргона, затем охлаждают в бане со льдом. Добавляют 15 мл воды и экстрагируют петролейным эфиром, гептаном или гексаном 3 раза по 50 мл. Водную фазу отделяют с помощью делительной воронки. Обьединенный экстракт желтого цвета промывают 2 раза водой до нейтральной реакции и высушивают над сульфатом аммония. Далее экстракт отфильтровывают, количественно переносят в колбу для выпаривания и упаривают под вакуумом при 45^оС. Сухой красно-оранжевый осадок растворяют в 2 мл смеси элюирования и наносят на колонку с водяной рубашкой размером 1,6 х 15 см. Хроматографию убихинона проводят на окиси алюминия для тонкослойной хроматографии фирмы "Woelm" (ФРГ) или окиси алюминия II степени по Брокману. Элюирование проводят смесью петролейный эфир (т.кип. 40-70^оС) хлороформсерный эфир (85:10:5), объем 100 мл. Фракцию, содержащую убихинон в виде ярко-оранжевой полосы с R_f 0,55, отделяют и упаривают. Рехроматографию проводят либо на пластинах Силуфола (ЧССР), либо с помощью второй колонки с окисью алюминия в системе петролейный эфир (т.кип. 40-70^оС) серный эфир ледяная уксусная кислота (90:30:1). Элюат упаривают и определяют количество убихинона взвешиванием или спектpофотометрически по поглощению спиртового раствора при 275 нм, используя молярный коэффициент экстинкции ε -14600 для кюветы с длиной оптического пути 1 см. Получают убихинон Q₁₀, выход которого составляет 4,3 мг на 1 г сухих клеток. П р и м е р 2. Фототрофные бактерии Thiocapsa roseopersicina ВКМ В-1613 выращивают на модифицированной среде Пфеннига следующего состава, г/л: NH₄Cl 1,0 KH₂PO₄ 1,0 NaHCO₃ 2,0 MgCl₂ 1,0 KCl 1,0 CH₃COONa 2,0 Na₂S˙ 9H₂O 1,0 NaCl 10,0 Na₂S₂O₃ 2,0 CaCl₂ 0,1 Микроэлементы, мл/л 1 Витамин В₁₂, мкг/л 12 Микроэлементы, мг/л: ZnSO₄ ˙7H₂O 100 MnCl₂ ˙4H₂O 30 H₃BO₃ 300 CoCl₂ ˙6H₂O 200 CuCl₂ ˙2H₂O 10 NiCl₂ ˙6H₂O 20 Na₂MoO₄ ˙2H₂O 30 FeCl₃ 200 Выращивание проводят на свету (20˙ 10³ эрг/см² ˙ с) при температуре 30^оС и рН 7,0-7,5. Клетки осаждают центрифугированием, лиофильно высушивают и после предварительного омыления липидов выделяют убихинон по примеру 1. Получают убихинон Q₈, выход которого составляет 2,2 мг на 1 г сухих клеток. П р и м е р 3. Фототрофные бактерии Ectоthiorhodospira Shaposhnikovii ВКМ В-1525 D выращивают на среде Ларссена следующего состава, NH₄Cl 0,05 KH₂PO₄ 0,1 MgCl₂ 0,05 NaCl 0,2 CaCl₂ 0,01 NaHCO₃ 0,5 FeCl₃ 0,01 Na₂S ˙9H₂O 0,01 CH₃COONa 0,2 Na₂S₂O₃ 0,3 Микроэлементы, мл/л 1 Состав микроэлементов, мг/л: H₃BO₃ 5,7 Co(NO₃)₂ ˙6H₂O 246 CuSO₄ ˙5H₂O 20 MnCl₂ ˙4H₂O 18 ZnSO₄ ˙7H₂O 430 Клетки выращивают на свету при температуре 30^оС и рН 8,3-8,6, сепарируют, высушивают лиофильно и выделяют убихинон по примеру 1. Убихинон Ectothiorhodospira Shaposhnikovii ВКМ В-1525 D идентифицирован как убихинон Q₇. Коэффициент экстинкции равен 14800 для 1 см кюветы при 275 нм. Выход убихинона Q₇ составляет 3,0 мг на 1 г сухих клеток. Таким образом, использование для получения убихинонов фототрофных бактерий позволяет в 10-20 раз увеличить их выход.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УБИХИНОНОВ, включающий культивирование микроорганизмов-продуцентов, отделение и омыление биомассы с последующим выделением убихинонов из неомыляемой фракции, отличающийся тем, что с целью повышения выхода убихинонов, в качестве микроорганизмов продуцентов используют фототрофные бактерии Rhodobacter capsulatus ВКМ В-1614 или Thiocapsa roseopersicina ВКМ В-1613, или Ectothiorhodospira Schaposhnikovii ВКМ В-1525D.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000

Извещение опубликовано: 27.12.2000        

---