Способ определения скорости окисления ортодианизидина в иммуноферментном анализе
Изобретение относится к медицине , точнее - к иммунохимии, касается скорости определения окисления ортодианизицина (о-ФА) в иммуноферментном анализе. Цель изобретения - увеличение стабильности результатов анализа за счет одновременного увеличения скорости реакции, стабилизации фермента и длительного сохранения оптической прозрачности оксидов Реакцию проводят в термостатированной кювете спектрофотометра, регистрируя поглощение света на длине волны 460 нм, соответствующей максимуму поглощения продуктов окисления о-ДА. По оптической плотности рассчитывают начальные скорости окисления о-ДА м с используя козффициент (Л молярной экстинции продуктов его окисления, равный 30000 ,
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (5))4 G О) N 33 53
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbITHA
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Ii >,,"
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 4063851/28-14; 4063852/28-)4 (22) 29.04.86 (46) 30.06.88. Бюл. Р 24 (71) Институт биоорганической химии АН БССР (72) А.Н.Еремин, M.È.Ñàâåíêoâà, В.А.Шибаев, Д.И.Метелица, В,В.Боча" ров, В.А.Миньков, А.Е.Фролов, Л.В.Наумкина, Ю,M.Âîëêîâ, В.В.Соженко, И.С.Ахметжанов, З.Г.Шевченко и А.А.Павлов (53) 612.015 (088 ° 8) (56) Porstman В., Porstman T. et al. Clin. chim. acta, 1981, ч. 109, р. 175-181. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ОКИСЛЕНИЯ ОРТОДИАНИЗИДИНА В ИММУНО- . ФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ „„SU„„1406487 А 1 (57) Изобретение относится к медицине, точнее — к иммунохимии, касается ско1ости определения окисления ортодианизицина (о-ФА) в иммуноферментном анализе. Цель изобретения — увеличение стабильности результатов анализа за счет одновременного увеличения скорости реакции, стабилизации фермента и длительного сохранения оптической прозрачности оксидов. Реакцию проводят в термостатированной кювете спектрофотометра, регистрируя поглощение света на длине волны 460 нм, соответствующей максимуму поглощения продуктов окисления о-ДА, а По оптической плотности рассчитыва- у ют начальные скорости окисления о-ДА м с, используя коэффициент молярной экстинции продуктов его окисления, равный 30000 м см 1406487 Изобретение относится к медицине, а именно к области иммунохимии и касается скорости определения окисления ортодианизидина в иммунофермент5 ном анализе. Цель изобретения — увеличение стабильности результатов эа счет одновременного увеличения скорости реакции, стабилизации фермента и длитель- !0 ного сохранения оптической прозрач ности оксидатов. Способ осуществляют следующим об" разом, Пример 1. В пробирку вносят 2 мл растнора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора ортодианизидина (о-ДА) 0,8 мл воцного раствора сополимеgapa 1 или 2. Реакцию начинают добавлеием 0 1 мл раствора перекиси водороа. Исходные концентрации реагентов. реакционной смеси объемом 3 мл равны: 0,31 нМ пероксидазы; 0,4 мМ 25 ,о-ДА; 1,О мМ перекиси водорода и i0,5 вес.Ж сополимера 1. Сополимер по-! ривинилового спирта и акриловой кис;лоты 10:1 или сополимера 2 (соотношение 4:1). Реакцию проводят в тер- 30 мостатированной кювете спектрофото иетра, регистрируя поглощение света на длине волны 460 нм, соответствую-! цей максимуму поглощения продуктов окисления ортодианизидина. По оптической, плотности рассчитывают началь1 алые скорости окисления о-ДА в M-c используя коэффициент молярной экстинкции продуктов его окисления, равный . 0000 М -см Пример 2. В 0,01 М фосфатный буфер с рН 7 5, содержащий 0,15 М NaC1, вносят пероксидазу или конъюгат пероксидазы хрена с тремя молекулами строфантина К до конечной концентрации 1,5 нМ и 0 5 вес.7 еополимера 1. Смесь выдерживают при 20 С разное время, отбирают аликвоты и определяют остаточную ферментативную активность конъюгата при окислении о-ДА в 0,1 M фосфатном буфере с рН 6,0; содержащим 0,2 мМ ортодианизидина. Реакцию при 20 С начинают добавлением пербората натрия до конечной концентрации 1,О MM и ведут ее 1 мин, реги55 стрируя оптическую плотность на длине волны 460 нм. Пример 3. В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее Ф конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора ортодианизидина, 0,8 мл раствора сополимера в том же буфере и добавляют 0,1 мл раствора перекиси нодорода. Концентрации реагентов в системе составляют: 0 15 нМ пероксидазы; 0,4 MM о"ДА", 1,0 HgO< и 0,1I сополимера 1. Во времени регистрируют светопропускание оксидата на длине волны 800 нм. Проведение пероксидазного окисления в присутствии сополимеров 1 или 2 обеспечивает повышение скорости реакции в 2,2 — 2,45 раза, увеличение термостабильности конъюгата пероксидазы со строфантином в 2,7 раза и увеличение светопропускания окси" дата в 4,5 раза, что делает возможным корректное определение начальных скоростей окислений ортодианизидина в течение длительного (более 3 ч) времени. Пример 4, В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора о-ДА и 0 8 мл раствора блок" сополимера 1 — блок-сополимер окисей пропилена и этилена с числом звеньев 5 и 15 соответственно, или блок-сополимера 2 (число звеньев 10 и 33) или блок-сополимера 3 (число звеньев 15 и 50). Реакцию начинают добанлением 0,1 мл раствора перекиси водорода. Исходные концентрации реаген" тов н реакционной смеси объемом 3 мл равны: 0,31 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ перекиси водорода и 0,1 7. блок-сополимеров. Реакцию проводят в термостатированной кювете спектрофотометра, регистрируя поглощение света на длине нолны 460 нм, соответствующей максимуму поглощения продуктов окисления ортодианизидина, Пример 5. В 0,01 М фосфатный буфер с рН 7>5, содержащий 0,15 M 1!аС1, вносят пероксидазу или конъюгат пероксидазы хрена с тремя молекулами строфантина К до конечной концентрации 1,5 нМ и 0,5 вес„Е блок-сополимера 1. Смесь выдерживают при 20 С разное время, отбирают аликвоты и определяют остаточную активность коньюгата при окислении о-ДА в 0,1 М цитра но-ацетатном буфере с рН 6,0, содержащем 0,2 или 0,4 мМ ортодианизи6487 15 25 55 з 140 дина. Реакцию при 20 С начинают доо бавлением 1,0 мМ пербората натрия и ведут ее 1 мин, регистрируя оптическую плотность на длине волны 460 нм. П р и и е р 6, В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 M фосфатном буфе1 е с рН 6,0; 0,1 мл раствора ортодианизидина, 0,8 мл раствора блок-сополимера 2 в том же буфере и добавляют 0,1 мл раствора перекиси водорода.-Концентрации реагентов в системе составляют: 0,15 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ И О и 0>1% блок-сополимера. Во времени регистрируют светопропускание оксидата на длине волны 800 нм. Проведение пероксидазного окисления в присутствии блок-сополимеров окисей пропилена и этилена обеспечивает повышение скорости реакции в l,33 раза, увеличение термостабильности конъюгата пероксидазы со строфантином в 2,88 раза и рост светопропускания оксидата в 4,4 раза,что делает возможным корректное определение начальных скоростей окисления ортодианизидина в течение длительного (более 3 ч) времени. Пример 7. В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора о-ДА и 0,8 мл раствора АЭП— алкиловые эфиры полиэтиленгликоля, фракция с n = 10 — 18 и m = 6 — 10 в том же буфере. Реакцию начинают до" бавлением 0,1 мл раствора перекиси водорода. Исходные концентрации реагентов в реакционной смеси общим объемом 3 мл равны: 0,31 нМ пероксидаэы, 0,4 мИ о-ДА; 1,0 мМ перекиси водорода и 0,1 % АЭП. Реакцию проводят в термостатированной кювете спектрофотометра, регистрируя поглощения света на длине волны 460 нм, соответствующей максимуму поглощения продуктов окисления ортодианизидина. Пример 8. В 0,01 M фосфатный буфер, содержащий 0,15 М NaC1, с рН 7,5 вносят пероксидазу или конъюгат пероксидазы хрена с тремя моле" хулами строфантина К до конечной концентрации 1,5 нИ и 0,5 %. АЭП. Смесь о выдерживают при 20 С разное время, отбирают аликвоты и определяют остаточную активность конъюгата в реакцни окисления о-ДА в 0>1 М фосфатном буфере с рН 6,0, содержащем 0,2 мИ о-ДА. Реакцию начинают добавлением пербората натрия до конечной концентрации 1,0 мИ и ведут ее 1 мин, регистрируя оптическую плотность на длине волны 460 нм. Пример 9. В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; О,l мл раствора о-ДА, 0,8 мл раствора АЭП в том же буфере и добавляют О,1 мл раствора перекиси водорода, Концентрации реагентов в реакционной смеси объемом 3 мл равны: 0 15 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ перекиси водорода и 0 5% АЭП. Во времени регистрируют светопропускание оксидатов на длине волны 800 нм. Проведение пероксидаэного окисления ортодианиэидина в присутствии АЭП обеспечивает повышение скорости реакции в 1,7 раза, увеличение термостабильности конъюгата пероксидазы со строфантином в 2,75 раза и увеличение светопропускания оксидатов, что делает возможным корректное иэмерение начальных скоростей окисления ортодианизидина в течение длительного времени (более 3 ч). По совокупности своих полезных характеристик АЭП превосходит Твин 20 и Плюроник Л-64„ Пример 10, В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора о-ДА и 0,8 мл раствора ЧСА (алкилтриметиламмонийхлорид с п = 7 — 18 (ЧСА-1), с и = 7 — 9 (ЧСА-2) и с п = 17 — 18 (ЧСА-3), а также алкилдиметилбензиламмоний с n = 10 — 18 (ЧСА-4) в том же буфере. Реакцию начинают добавлением О>1 мл раствора перекиси водорода. Исходные концентрации реагентов в реакционной смеси общим объемом 3 мл равны: 0,31 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ЦА 1,0 мМ водорода и 0,5% ЧСА-1. Реакцию проводят в термостатированной кювете спектрофотометра, регистрируя поглощение света на длине волны 460 нм, соответствующей максимуму поглощения продуктов окисления ортодианиэидина. Пример ll. В 0,0) И фосфатный буфер с рН 7,5, содержащий ВНИИПИ Заказ 3185/39 Тираж 847 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 5 14064 0,15 M NaC1,, вносят пероксидазу или 1 онъюгат пероксидазы хрена с тремя Молекулами строфантина К, до конечНой концентрации 1 5 нМ и 0,5 вес.7. ЧСА-1. Смесь выдерживают при 20 С о разное время, отбирают аликвоты и Определяют остаточную ферментативную активность конъюгата при окислении о-ДА в 0,1 М фосфатном буфере с рН 10 6,0, содержащим 0,2 мМ ортодианизиина. Реакцию начинают добавлением ербората натрия до конечной концентации 1,0 мМ и ведут ее 1 мин, реги1 трируя оптическую плотность на дли- )6 не волны 460 нм. Пример 12. В пробирку вносят мл раствора пероксидазы или ее онъюгата со строфантином К в 0,02 М осфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл 20 аствора о-ДА, 0,8 мл раствора ЧСА-1 том я<е буфере и добавляют 0,1 мл аствора перекиси водорода. Концентация реагентов в системе составляет: ,15 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА; 25 ,0 MM перекиси водорода и 0,57. ЧСА-1. о времени регистрируют светопропусание оксидата на длине волны 800 нм. отсутствие ЧСА-1 светопропускание падает очень быстро до . 20Е от на- 30 ,ального уровня, в то время как в присутствии ЧСА-1 светопропускание фксидата изменяется медленно до 927. фт начального уровня. Проведение пероксидазного окисле1 ния ортодианизидина в присутствии 1етвертичных солей аммония 1-4 обеспечивает повышение скорости реаки в 2 раза, увеличение термостаильности конъюгата пероксидазы со 4р трофантином К в 2,86 раза и увеличение светопропускания оксидатов в 4,6 раза; что делает возможным корректное измерение начальных скорос ей окисления ортодианизидина в те- 45 чеиие длительного времени (более 3 ч), Таким образом, все указанные вещества позволяю увеличить стабильность результатов анализа за счет одновременного увеличения скорости б0 реакции, стабилизации фермента и .Длительного сохранения оптической 87 6 прозрачности оксидатов. Используемые в прототипе детергенты : Твин-20, Плюроник 1 = 64,Тритон Х-100 таким комплексом полезных свойств не обладают, так как Твин-20 не .обнаружил стабилизирующего эффекта, Плюроник 1 = 64 практически не влияет на прозрачность реакционной смеси, а Тритон Х-100 сам эффективно окисляется пероксидазой хрена, что вызывает инициирование деструкции биокатализатора, Поэтому их использование ограничено. формула изобретения Способ определения скорости окисления ортодианизидина в иммуноферментном анализе путем инкубирования пероксидазы хрена ипи ее конъюгатов со строфантином К и перекиси водорода . или пербората йатрия в присутствии поверхностно"активных веществ, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения стабильности результатов анализа за счет одновременного увеличения скорости реакции, стабилизации фермента и длительного сохранения оптической прозрачности оксидатов, в качестве поверхностно-активного вещества используют привитой сополимер поливинилового спирта и акриповой кислоты с соотношением компонентов (4-10):1, или блок-сополимеры окисей пропилена и этилена с длиной алкильного радикала С - С и числом . звеньев 5 — 15 и 15 — 50 для окисей I пропилена и этилена соответственно, илн алкиловые эфиры полиэтиленгликоля С„Н,„+„0(С П С) „,Н, где п = 10 — 18; In=6-10, или хлориды алкилтриметиламмония (з)з С.Н 1 * где и = 7 — )8, и алкилдиметилбензиламмония 1(СН ) (С Í, )11 СП С,Н,)Ci где и = 10 — 18.
