Способ определения ростовой характеристики питательных сред для клеточных культур

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для оценки ростовых свойств питательных сред, а также для оценки токсичности их компонентов и различных добавок к питательным средам. Целью изобретения является упрощение способа . Способ заключается в том, что в исследуемой питательной среде измеряют содержание карбонильных соединений , выращивают на этой среде клетки ВНК-21 в качестве тесткультуры в течение 2-4 дней, подсчитывают их количество, определяют индекс пролиферации первого пассажа и измеряют уровень карбонильных соединений в надклеточной жидкости. Затем по выведенному уравнению для клеток ВНК- 21 находят ожидаемое среднее значение индекса пролиферации по четырем D пассажам: Ш1,.4 14,3-57,3 , где П , величина прироста оптической плотности при длине волны 505 нм, свидетельствующая об изменении концентраций оснований Шиффа, образующихся при взаимодействии апьдегидов (кетонов) с 2,,4-диннтрофенилгидразином, характеризующая уровень карбонильных соединений; ИЩ- индекс пролиферации, соответствующий отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе; Ш1,.4- среднее значение индекса пролиферации по четырем пассажам. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. с $ ьэ ел сд to

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИО ЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУЬЛИН

ГОСУцАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОЕРЕТЕНИй И ОТНРЫТИй (21) 4073634/28-13 (22) 02.06.86 (46) 23.09,88.. Бюл. 9 35 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) Г.И.Распопина, А.H.Äåöèíà, А.Г.Бачинский и 10.В.Кондрахин (53) 663 ° 15 (088 ° 8) (56) Lim D. А. rapid biochemical

test for measuring chemical toxicity. — Bull.Contam.Toxico1. 1981

v.26, У 2, р. 145-149.

Metcalte S.M. Cell culture as a

test system for toxicity. J.Pharm.

Pharmae. 1971 9 23, р.817-824. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОСТОВОЙ

ХАРАКТЕРИСТИКИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ

КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР (57) Изобретение относится к Ъиотехнологии и может быть использовано для оценки ростовых свойств питательных сред, а также для оценки токсичности их компонентов и различных добавок к питательным средам. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том, что в

„„SU„„1425542 А1 (pe y G .01 N 33/48, С 12 N 5/00 исследуемой питательной среде измеряют содержание карбонильных соединений, выращивают на этой среде клетки ВНК-21 в качестве тесткультуры в течение 2 — 4 дней, подсчитывают их количество, определяют индекс пролиферации первого пассажа и измеряют уровень карбонильных соединений в надклеточной жидкости. Затем по выведенному уравнению для клеток ВНК21 находят ожидаемое среднее значение индекса пролиферации по четырем

gSC5 пассажам: ИП, 4 =14,3-57 3— 5 где р -, — величина прироста оптической плотности при длине волны

505 нм, свидетельствующая об изменении концентраций оснований Шиффа, образующихся при взаимодействии альдегидов (кетонов) с 2,4-цинитрофеннлгидразином, характеризующая уровень карбонильных соединений; ИП индекс пролиферации, соответствующий отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе; ИП, 4 - среднее значение индекса пролиферации по четырем пассажам.

1 s.ï. ф-лы, 1 табл.

1425542

505 ! где О, величина прироста опт и-. ческой :тлоткости при

ЗО длине волны 5О5 км, свидетельствующая об изменении. концентрации осно" ваний Шиффа, образующих- ся при взаимодействии

/ яльдегидов (кетонов) с

2,4-динитрофенилгидраэином, характеризующая уро-вень карбонильных соеди нении 9

4О индекс пролиферат ии, соответствующии отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе; среднее значекие иццекса полиферации по четыИП, ИП, 4 реи пт сажам.

Э

УРЯВНЕКИЕ IIOII eHO КЯ. ОСНОВакИИ статистического анализа регрессионным методом базовых экспериментальных данных (и:= 32):, .включающих измерение величикы АП,,, ИП,„. 3„ т для широкого набора различных по качеству питательных сред.„. приготовленных на основе индивидуальных аминокислот или белковых гидролизатов. о F03

При значениях отношения О /ИП, >0,25 питательные среды имеют ИП,, -.

Изобретение î" íîñèòñÿ к биотехнологии и может быть использовано для оценки ростовых свойств гитательных сред, а также для оценки токсичности их компонентов и различных добавок к питательным средам.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа.

Способ осуществляется следующим, образом.

В исследуемой питятегп-,ной среде

: измеряют содержание карбонильжтх со, единений, выращивают на "-той среде клетки BHK-21 в качестве тест-куль туры в течение 2".4 дней,. подсчиты вают их кбличество, определяют ин=. декс пролиферяции первого пассажа

1, (ИП ) и измеряют уровень карбонильI ных соединенич в надклеточкой жид; .кости, затем по выведенному уравке1, кию для клеток BHK-21 находят ожидя1

I емое среднее значение индекса проли1, ферации по четырем пассажам ИП„,„q

I !

О.;

ИП = (43- 57 3 тф 9 Р И.П I

<3 {для клеток BHK--21) и считаются .токсичными. При значениях этого отношения « 0,25 предлагаемый способ позволяет предскаэывать значения

ИП, q, в интервале от 3 до 13 с доверительным интервалом + 2,б ед. ИП при уровне вероятности 95 7..

Наличие таких зависимостей связано с тем, что клетки при культивировании испытывают комплекс воздействий со стороны окружающей среды (ка" личие ионов переходных металлов, окислителей и т.д.), которые вызывают интенсификацию процесса перекисного окисления липидов, ведущего к накоплению карбонильных соединений типа малонового диальдегида.

В некоторых случаях карбонилькые соединения в определенных концентрациях сами по себе могут оказывать токсическое действие на клеточкъте культуры.

Новыми признаками способа являют-. ся измерение содержания карбонильных соединений в питательной среде до и после выращивания на ней. попу ляции клеток BHK-21 и определение ростовых свойств рассматриваемой питательной среды по приросту карбонильных соединений с использованием статистически отработанного уравнекия

Данная совокупность признаков способа приводит к значительному сокращению времени проведения анализа, упрощению и удешевлению способа получения количественных характерис" тик ростовых свойств питателькых ср ед с

Способ определения ростовых характеристик питательных сред для клеточных культур ВНК-21 позволяет в течение одной рабочей сиены протестировать свыше шести образцов питательных сред. Способ целесообразно применять для оценки ростовых свойств при конструировании новых питательньм сред, пригодности сырья в производстве питательных сред, а также при изучении влияния различных химических веществ ка рост клеточных культур и таким образом зконоьл".ть время, материалы, реактивы и снижать трудозатраты. Ок расширяет арсенал средств для контроля токCNBViOCTH H РОСТОВЫХ СВОйС

25542

4 ние ИП», равное 0 3 что свиде» тельствует о токсичности этой пита5>5

О»

5 тательной среды (— — — (О, 25} . Эта

ИП, величина также удовлетворительно согласуется с экспериментальным значением ИП„ p .

Приведенные данные подтверждают применимость предлагаемого способа для определения ростовых характеристик питательных сред.

14

Пример. Измеряют содержание карбонильных соединений в анализируемой питательной среде по их реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

Для этого в пробирку, содержащую

0,6 мл анализируемой среды, добавляют 0,5 мл 0,27.-ного раствсфа 2,4.динитрофенилгидразина в 1 н раствора соляной кислоты, затем 2 мл 0,4 н.

Na0H. Пробу вьдерживают оба раза при комнатной температуре в течение

10-15 мин и измеряют оптическую плотность поглощения раствора при длине волны 505 нм с помощью спетрофотометра СФ-16 в кювете (1 = 1 см).

Далее выращивают клетки ВНК-21 на анализируемой среде. Для этого клетки, вьдерживаемые на контроль йой питательной среде, разводят в стерильных условиях до оптимальной посевной концентрации анализируемой питательной средой и рассеивают в два (или 3-4) культуральных сосуда с посадочной дозой 100 тыс.кл/мл, закрывают пробками и маркируют. Культуральные сосуды инкубируют в термостате при 37 С; через три дня надклеточную жидкость сливают для оценки уровня карбонильных соединений с.помощью 2,4-динитрофенилгидразина и подсчитывают клетки, предварительно переводя их в суспензию, с помощью камеры Горяева (нестерильно), определяя таким образом величину ИП .

При оценке уровня карбонильных соединений и подсчете количества клеток используют оба культуральных сосуда для определения средних арифметических указанных величин.

Прогнозируемое среднее значение индекса пролиферации по четырем пассажам (ИП, д ) вычисляют по формуле.

Результаты таких расчетов для

Опытных cpep (ИП»,,»» дц ». ) В сопос тавлении с экспериментальными данными (ИП»- а э»,спериме»,т ) по известному способу приведены в таблице.

Из приведенных в таблице данных следует, что расчетные и экспериментальные величины ИП »,„ для питальных сред 2-6 находятся в удовлетворительном согласии и свидетельствуют о высоких ростовых свойствах. Для образца 1 получено расчетное значеФормула изобретения

1. Способ определения ростовой характеристики питательных сред для клеточных культур, предусматривающий выращивание тест-культуры на испытуемой среде и определение среднего значения индекса пролиферации по первым четырем пассажам с последующей оценкой полученных результатов, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, среднее значение индекса пролиферации по первым четырем пассажам определяют путем измерения о содержания карбонильных соединений

З0 в питательной среде до и после культивирования тест-культуры в течение первого пассажа и по приросту их концентрации в расчете на одну клетку, а оценку полученных результатов производят по формуле:

ИП = 14 3 — 57 3 — —

»-4 э ИП

»

5O$ где О, — величина прироста оптической плотности при длине волны 505 нм, характеризующая уровень карбонильных соединений;

ИП, — индекс пролиферации, 45 соответствующий отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе;

ИП, — среднее значение индек50 са пролиферации по четырем пассажам.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве тесткультуры используют штамм культивируемых клеток животных ВНК-21.

1425542

Индекс пролиферации клеток ВНК-21

Средние величины индексов пролиферации клеток BHK-21 по четнрем пассажаи

Аналнеируеиая среда

Оптичес оре плотности прост онечисходная, 0 Ррг р рср

ННi-s рарчет D.эт (по предложенному способу) I

НИр-а рр вар а2ег (no нэвестноиу способу) после первого пассажа, ИП, ая

0,3 g 2,6

12р1 + 2рб

12,2 х 2 ° 6

f,6й 2,7

1Зр3 + 2,1

12р2 х 0,9

Ор23 1р33 1р3

0,24 О, 7G Ор32

Ор23 0,77 Ор82

ЛСЯ 40Р

ЙСС (ВНК" 21) с9

13,7

ЙСС(ВНК-2! ) с9 аргинин отеч. рроиэводства

I!CC(BHK-2I)c8

13;9

0,24 1,40 1,16

0 22 0 13 0 9 I

8р0 + 2рб

9р3 + 2,6

10,3

10р! и Ь>4

11,7 i 9,9

12,4 и 6,3

11СЯ 44Р

«СЯ 45Р

10р9

10,8

0,23 1,11 0,88

9рб + 2рб

Составитель Л,Минеева

Корректор С.Черни

Редактор Г.Волкова

Заказ 4761/40 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР но делам изобретений и открытий l13035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Приведенные в таблице нитатель1!ые среды не входят в число базовых, 20 фоторые были использованы для определения коэффициентов уравнения.

Среда. ПСС (ВНК-21) содержит, мг/л: NaC1 5800, КС1 360; ИаНЯРО)»

Я2НЯО 140; СаС1 90; MQS04 7Но0 1801 25 глюкоза 4500; феноловый красный 7э

1-аргинин НС1 127,6; 1-цистин 32;

1-глутамин 584; 1-гистидин НС1 11,;

-изолейцин 25; 1-лейцин 33; 1-лизин

0; 1-метионин 38; 1-фениланин 15;

1-треонин 46; 1-триптофан 15 1-тирозин 32; 1-валин 50; 1-серии 56;

2 ОЛИНХЛОРИД 3; фОЛИЕВаЯ КИСЛОта Зэ

6)езоинозит 6; никотинамид 3, пантотенат кальция 3; пиридоксаль гидроМлорид 3, тиамингидрохлорид 3; рибофлавин 0,3; ЯаНСО 2500; сыворотка

Крупного рогатого скота 100 мл/л.

Для приготовления этих питательных сред используют аминокислоты 40 фирмы "Сигма" (СНА), остальные реактивы отечественного производотва квалификации ч. и х.ч, В одном случае к среде ПСС(ВНК-21) добавляют дополнительно 127,6 мг/л 1 -аргинин 45 гидрохлорида.

В средах ПСЯ 40Р ПСЯ 44Р и ПСЯ

45Р вместо 1-гистидина, 1-изолейцина, 1-лейцина, 1-лизина, 1-метионина, 1-фенилаланина, 1-треонина, 1 тйрозина, 1-валина и 1-серина добавляют 2220 мг/л ферментативного гидролизата протеинов "миражного" яйца (отходы птицеводства), полученного в разных условиях (4ОР-длительность гидролиза 4 ч, без очистки; 44Р— длительность гидролиза 5 ч, без очистки; 45Р— длительность гидролиза 5 ч, очистка с активированным углем марки ОУЛ).

Доверительный интервал Х при уровне вероятности 95 Ж получен в результате статистического анализа отклонения базовых экспериментальных данных (n = 32) от их значений, вычисленных.по формуле. Доверительный интервал 1 9 при уровне вероятности 95 4 получен в результате статистического анализа вариаций при экспериментальном определении ИП! 4, при этом используют усредненное значение величины квадратичного отклонения для четырех пассажей.