Способ выявления химических веществ,направленно влияющих на функцию коры надпочечных желез

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (П) (51) 4 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3995744/28-14 (22) 23.12.85 (46) 30 ° 09.88. Бюл. У 36 (71) Киевский научно-исследовательский институт эндокрннологии и обмена веществ; и Всесоюзный научно-исследовательский институт гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс (72) С.В.Кандул, М.И.Яцык и В.Я.Кононенко (53) 616.07 (088.8) (56) Uernikos - Danellis J.et.all, Changes in adrenal corticostегоne

concentration in rats: method of

bioassay for ACTH. — Endocrinology, 1966, 70, v 3> р. 624-630. (54). СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ХИМИЧЕСКИХ

ВЕЩЕСТВ, НАПРАВЛЕННО ВЛИЯЮЩИХ HA

ФУНКЦИЮ КОРЫ НАДПОЧЕЧНЫХ ЖЕЛЕЗ (57) Изобретение относится к эндокринологии. Цель изобретения — ускорение и упрощение способа, Белым крысам вводят изучаемое соединение. После декапитации у крыс извлекают надпочечники и замораживают. Затем образцы помещают в кварцевый сосуд Дьюара и регистрируют электронно-парамагнитный резонанс (ЭПР). Интенсивность сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках крыс, которым вводят изучаемое соединение, сопоставляют с величиной этого сигнала в надпочечниках интактных животных. Отмечено, что фенобарбитал вызывает значительное увеличение интенсивности сигналов

ЭПР феррицитохрома P-450. Это свидетельствует о существенном влиянии этого препарата на функцию надпочечников. 2 ил., 3 табл..1427302

:" soáðeYåHèå относится к медицине, а :-менна к эндокринологии, и может быть использована для первичного скрининга новых биологически активных 5 соединении, обладающих адренакортикотрапнай активностью.

Цель изобретения — ускорение и утращение способа.

Способ осуществляется следующим образам.

Материалом для исследования служат белыс крысы-самцы массой 100. 200 г,, которым внутримышечно вводят изучаемое соединение. Через определенные промежутки времени, например.

20, 40, 60., 120 и т.д. мин, крыс декапитируют и тот час извлекают над/ почечники. очищают на холоде от жиро" вой клетчатки и замораживают в жид." 20 ком азоте. Замороженные образцы помещают и кварцевый сосуд. Дьюара и регистрируют на радиоспектраметре ЭПР.

Запись спектров проводят по общепринятой методике при 77К (-196 С), ра- 25 бочей частоте спектрометра 9,5 Гц, напряженности магнитного поля 265Зб5 мТл., развертке поля 100 мТл, скорости развертки 25 мТл, постоянной времени 0,5 с, амплитуде модуляции

0,8 мТл и мощности падающей СВЧ 5 мВт.

В качестве внутреннего стандарта служит кристыьч рубина помещенный в рабочем объеме резонатора. Спектр

ЭПР феррицитохрома Р-450 характеризу- ется g-факторами 2,42 и 2,25 (фиг.1).

Изменение веюп чины сигнала ЭПР феррицитахрама Р-450 рассчитывают по наиболее интенсивной компоненте с g =

= 2,25, величина которой пропорцио" нальна содержанию феррицитохрома

Р-450. Содержание этой формы цитохрома Р-450 в надпочечниках выражают в

t относительных единицах.

Интенсивность сигнала ЭПР феррици- 45

".oõðîNà P-450 в надпочечииках под-опытных крыс, которым вводят изучаемое соединение, сопоставляют с вели" чинай этого сигнала в надпочечниках контрольных животных GOJI7÷çþùèõ

50 только растворитель для данного вещества. Наличие регуляторной функции у изучаемого химического, вещества основывается на выявлении изменения интенсивности сигнала ЭПР феррицитохрама Р-450 в надпочечниках опытнь1х

55 крыс по отношению к величине аналогичного показателя в .надпочечниках контрольных животных.

Используют известные фармакопейные препараты, активизирующие функцию коры надпочечных желез, а именно картикотрапин (АКТГ, ) (СССР) и синактен-депо (AKTI, ) (Швейцария), а также ингибитар секреции АКТГ из гипофиза — дексаметазон (Югославия).

Пример . Исследовали химические вещества, неизвестные па своему действию на функцию коры надпочечных желез: вилозен (препарат из вилочковой железы телят), децис и перметрин (вещества, обладающие свойствами инсектицидов), фенабарбитал (препарат, обладающий снотворным и противосудорожным действием).

Все перечисленные выше вещества вводили крысам-самцам массой 100200 г .натощак однократно внутримышечно. Вещества растворяли в физио-. логическом растворе. Величину дозы рассчитывали исходя из массы животного. Исследования проводили 20120 мин. Крысам контрольных групп вводили. эквивалентные объемы физиологического раствора.

Животных декапитировали. Обработ". ку надпочечников проводили по опи-. санной выше методике. Результаты исследований представлены на фиг. 2, где 1-кортикотропин, 2-синактен, 3-вилозен, 4-децис, 5-перметрин, б-фенобарбитал, 7-дексаметазон.

Изменение интенсивности сигнала

ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках крыс после введения кортикотро-= пина (И + ш отн. ед.; n = 5-6) показано в табл. 1.

При изучении характера воздействия синактена-депо на интенсивность сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках крыс установлено сле-. дующее. Спустя 60 мин,после однократ1 ной инъекции препарата в дозе

2,5 ед/ 100 r массы крысы величина сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпачечниках снизилась на 45% (3,3+0 3 отн. ед. в контроле и 1,6+

+0,2 атн. ед. в опыте). Через 120 мин величина этого сигнала в надпочечниках опытных крыс возвращается к норме (4 2+0 6 отн. ед. в контроле и

3,4+0,4 атн. ед. в опыте). Следовательно, при воздействии химических веществ, активизирующих функцию коры надпочечных желез, интенсивность сигнала ЭПР феррицитахрома Р-450 в надпачечниках крыс снижается.

14П302

Синтетический глюкокортикоид дексаметазон, как известно является эффективным блокатором секреции ЛКТГ гипофизом, угнетая тем самым функцию

5 коры надпочечников. установлено что

9 спустя 60 мин после однократной инъекции дексаметазона в дозе 2мг/.

100 г массы крысы интенсивность сигнала ЭПР феррицитохрома P-450 в над- 10 почечниках опытных крыс увеличивается на 507 (6,0+0,4 отн, ед. в контроле и 9,0+О,? отн, ед. в опыте), Через

120 мин величина этого сигнала в надпочечниках опытных крыс увеличивает- 15 ся на 827 (5,0+0,2 отн, ед. в контроле и 9,1+0,2 отн. ед. в опыте). Следовательно, под влиянием химических веществ, вызывающих угнетение функции гипофизарно-надпочечниковой сис- 20 темы, интенсивность сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках увеличивается.

Изменение интенсивности сигнала

ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочеч- 25 никах крыс после введения вилоэена (50 мгк/100 г массы) и фенобарбитала (8 мг/100 г массы) (M + +m отн. ед.; п = 5) приведено в табл. 2, Как видно из результатов, пред- 3р ставленных в табл. 2, под влиянием стресса (инъекции физиологического раствора) наблюдается достоверное снижение величины сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках контрольных животных, В таких условиях, 35 как известно, усиливается процесс

Ыортикостероидогенеза, Вилоэен, по видимому, гроявляет неспецифическое действие, оказывая кратковременный эффект на кору надпочечников, а фенобарбитал вызывает значительное увеличение интенсивности сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450, что свидетельствует о существенном влиянии этого бар- 45 битурата на функцию надпочечных желез, Изменение интенсивности сигнала

ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках крыс после введения дециса (60 мкг/100 r массы) и перметрина (60 мкг/100 г массы) (М + в, отн.ед,; п = 5) приведено в табл, 3, Данные, представленные в табл, 3, также свидетельствуют о том, что увеличение секреции кортикотропина под влиянием стресса вызывает снижение величины сигнала ЭПР феррицитохрома

P-ч50 в надпочечниках контрольньг( крыс. Децис (С ., Н „ В N0 ) и .,ерметрин (С z Н О С1 ) существенного влияния на функцию коры надпочечньж желез не оказывают.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что из четырех химических веществ, действие которых на функцию коры надпочечннх желез было неизвестно, только фенобарбитал оказывает отчетливое изменение интенсивности сигнала ЭПР феррицитохрома P-450, Фенобарбитал угнетающе действует на функциональную активность коры надпочечных желез, оказывая репрессивное влияние на гипофизарно-надпочечниковую систему, Для уточнения точки приложения действия фенобарбитала требуются дополнительные исследования.

Формула изобретения

Способ выявления химических веществ, направлеHHo влияющих на функцию коры надпочечных желез, путем введения вещества лабораторному животному, удаления надпочечников и их исследования, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, надпочечники исследуют методом электронно-парамагнитного резонанса, определяют величину сигнала ниэкоспиновой окисленной формы цитохрома Р-450 и по ее изменению

I относительно контроля судят о наличии регуляторной функции химического вещества.

1427302 таблица 1

N + ш, отн, ед

Доза, ед

Опыт

Контроль

2,5 0,3

2,5+0,З

4,9+1,0

0,5 20

0,1

2,6+0,6

2,5

5,0

7,3+0,7

0,5 60

1,0

2,5

3,3 0,3

5,0

0,5 . 120

5,5+1,0

0,1

5 0

Достоверность различий относительно контроля P < 0 ° 05, 1

Таблица 2

Время воздействия мин

М + ш отн. ед.

Вилозен

Фенобарбитал онтроль

60

120

Достоверность различий относительно контроля Р(0,05.

Продолжительность воздействия, мин

5, 1+0,4

4,2+0,4

3,7+0,3

3,7+0,3

7,9+0,8, 4,6+0,5

2,5+0,2

3,9+0,7

2,6+0,3

3,7+0,3

5,2+0,6

4,0+0,4

5,0+0,4

4,2+0,6

10,1+0,8

10,0 1,5

10 7+0 8,1427302

Таблица 3 д ствия, мин

Контроль Децис Перметрин

5,3+0,4 4,4+0,4 3,4+0,4

60

4,4+0,4

3,6+0,4

120

Достоверность различий относительно контроля Р< 0,05.

Время воз ей- М + m отн. ед, 5,3 0,6

4,5+О,1

4,3+0,4

5,310,8

1427302

15

20

120 >p N8, псе

Составитель Е.Колмакова

Редактор И.Рыбченко Техред N.Дидык Корректор В.Романенко

Заказ 4849/42 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r, Ужгород, ул. Проектная, 4