Способ определения проницаемости мембраны эритроцитов и концентрации кальция в цитоплазме
Изобретение может быть использовано для оценки состояния мембранных процессов при гипертонической болезни. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа. Суспензию эритроцитов инкубируют о и после добавления раствора 9-аминодиметилкарбокси-7-метокси-2-(3-окси-4-аминометилкарбоксифенил)-хинолина в диметилсульфоксиде. Затем в суспензию добавляют изотоп Са в количестве 1,0 - 4,0 мкКи/мл. Регистрируют содержание кальция в эритроцитах через 15-20 и 2АО-260 мин инкубации. Определяют удельную активность Са в среде инкубации и объем эритроцитов. Затем рассчитывают проницаемость мембраны и концентрацию свободного кальция в цитоплазме . При гипертонической болезни скорость входа кальция в эритроциты увеличена на 25%. 3 табл. (С (Л
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН
„„SU„„1429020 А1
1511 4 С О1 N 33/48, А 61 В 6/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3947900/28-14 (22) 04.07.85 (46) 07. 10.88. Бюл. № 37 (7 1) Центральная научно-исследовательская лаборатория Четвертого главного управления при Министерстве здравоохранения СССР (72) С.Н ° Орлов, Н.И. Покудин и Ю.В. Постнов (53) 616-07(088.8) (56) Х. Cell ° Biol, 1982, v. 94, р. 325-334. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ И КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЬЦИЯ В ЦИТОПЛАЗМЕ (57) Изобретение может быть использовано для оценки состояния мембранных процессов при гипертонической болезни.
Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа ° Суспензию эритроцитов инкубируют до и после добавления раствора 9-аминодиметилкарбокси-7-метокси-2-(3-окси-4-аминометилкарбоксифенил) -хинолина в диметилсульфоксиде. Затем в суспензию добавляют изотоп Са в количестве 1,0 Х
4,0 мкКи/мл. Регистрируют содержание кальция в эритроцитах через 15-20 и
240-260 мин инкубации. Определяют удельную активность Са в среде инкубации и объем эритроцитов. Затем рассчитывают проницаемость мембраны и концентрацию-свободного кальция в цитоплазме ° При гипертонической болезни а скорость входа кальция в эритроциты и увеличена на 257 ° 3 табл.
1 14290
Изобретение относится Y. медицине и жет быть использовано для оценки со тояния мембранных процессов при г ертонической болезни.
Целью изобретения является повышение точности при упрощении способа за сЧет применения изотопа Са в,кон,центрации 1,0-4,0 мкКи/мл и регистрации его в эритроцитах через определен-10 н е сроки инкубации.
Способ осуществляют следующим обр зом.
Из взятой для биохимического анал за крови отбирают 5 мл и центрифу- 15 г уют при 1000 g в течение 10 мин. азму и клетки белой крови удаляют. ставшиеся эритроциты трижды промывают при тех же условиях центрифугиования в среде следующего состава: 20
50 мл NaC1 и 5 мм Na-фосфатного,буера (рН 7,4). К 1 мл упакованных ритроцитов добавляют 4 мл среды, соержащей 145 мМ NaC1, 5 шМ КС1, 1 mN
Cl 1 мМ СаС1,, 10 мМ глюкозы, 25 мМ Na ° ° (pH 7,4), и 1 г на 100 мл среды сыороточного альбумина (V фракция). Суспензию эритроцитов инкубируют в о течение 20 мин при 37 C после чего до- 1обавляют, например, 50 мМ раствора , 9-аминодиметилкар бокси-7-меток си-2(3-окси-4-амин Ометилкар6оксифенил)— хинолина в диметилсульфоксиде до конечной концентрации 150 мкМ, Суспено, зию эритроцитов инкубируют при 37 С в течение 90 мин. Нагруженная указан, ным соединением суспензия эритроцитов может непосредственно использоваться для дальнейшего анализа, а может и 40 храниться при 0-2 С в течение 2 сут без изменения исследуемых параметров. Суспензию в количестве 1,5 мл цен трифугируют при указанных условиях и ! äâàæäû промывают в среде, содержащей 145 мМ NaC1, 5 мМ КС1, 1 мМ IigC12, 1 мМ СаС12, 10 мИ Глюкозы 1 мМ Na2HP04, 10 мМ трис-НС1 буфера (рН 7,4), ресуспенцируют в той же среде до конечного объема i 5 мл и инкубио 50 руют при 37 С в течение 20 мин. В полученную суспензию добавляют радиоактивный изотоп Са в количестве 1,04,0 мкКи/мл. Уменьшение радиоактивности меньше 1, 0 мкКи/мл приводит к снижению точности измерения, так как количество изотопа, накапливаемого в клетках, недостаточно для достоверной регистрации на жидкостно-сцинциляцион-, 20 ном спектрометре. Увеличение концентрации более 4,0 мкКи/мл существенно не повышает точность измерения, но приводит к повышению общего фона радиоактивности на рабочем месте и к повышению стоимости каждого реализа. Суспензию эритроцитов, содержащую Са, инкубируют при 37 С. Через 15 и 240 мин отбирают по 200 мкл суспензии, переносят ее в 1 мл среды, содержащей 150 мМ NaC1, трис-НС1 буфера (рН 7,4; 0-2 С) и О, 1 мМ ЭДТА, и центрифугируют при указанных условиях. Полученный осадок эритроцитов вновь промывают при тех же условиях и обрабатывают путем добавления 0,4 мл, 0,25Х-ного раствора тритона Х 100 и 0,5 мл 107-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Белки осаждают при 2000 g в течение 10 мин, а 0,8 мл супернатанта переносят в диоксановый сцинцилятор и определяют радиоактивность. Указанные 15 и 240 мин являются оптимальным временем выборки, так как кинетика аккумуляции эритроцитами Са носит линейный характер вплоть до 30 мин инкубации. Поэтому в процессе определения проницаемости мембраны зритроцитов для кальция время. инкубации ограничено 15 мин. Кинетика аккумуляции 4 Са эритроцитами достигает насыщения к 240 мин (4 ч) инкубации. Количество радиоактивного кальция, находящееся в клетках, к этому времени используют для расчета концентрации свободного кальция в цитоплазме. Для определения проницаемости мембраны эритроцитов для кальция используют формулу 5 й1 aVt где К вЂ” проницаемость мембраны эритроцитов, нмоль/л клеток в 1 мин; А1 — радиоактивность " Ca в эритроцитах через 15 мин инкубации, cpm; а — удельная радиоактивность Са в среде инкубации, cpm/íìoëü; V — объем эритроцитов в пробе,л; — время инкубации, мин. Для определения концентрации каль. ция в цитоплазме используют формулу 2и "" Добавки Контроль (без добавок) 950+30 9313 Хинндин (10 мкМ) Трифторперазин (30 мкМ) Таблица 1 ГСа j нМ К нмоль/л клеток в 1 мин Измерение 980 100 860 1052 890 103 953 965 M+m 950+30 93+3 табл. 3. 3 142902 где LCa 3- концентрация кальция в эритроцитах, нМ; К 115 нМ вЂ” константа сродства кальция к 9-аминодиметилкар- 5 бок си-7-метокси-2- (3окси-4-аминометилкарбоксифенил)-хинолину; А.. — радиоактивность Са в 24о " эритроцитах через 240мин 10 инкубации, cpm;  — концентрация 9-аминодиметилкарбокси-7-метокси2-(3-окси-4-аминометилкарбоксифенил)-хинолина,. 15 нмоль/л клеток. Полученные величины скорости аккумуляции и свободной концентрации кальция в цитоплазме эритроцитов используют для оценки состояния мемб- 20 раны. Пример 1. Воспроизводимость метода показана в результате проведения следующих исследований. У одного пациента в течение месяца делались 25 заборы крови и определялись величины проницаемости мембраны эритроцитов для кальция и концентрация свободного кальция в цитоплазме. В табл. 1 приведены результаты проницаемости мембраны.эритроцитов для кальция (К) и концентрация кальция ((Са "j) в цитоплазме эритроцитов. Из анализа табл. 1 следует вывод о том, что статистически достоверно достигаемый результат измерения опре0 4 деляется с погрешностью не выше 10Х для К и 15Х для (Са ). Погрешность при определении величины К и (Са 3 М с помощью известного метода составляет 60-70 и 30-40Х соответственно (1-3), Пример 2. Использование предлагаемого метода для оценки эффективности действия лекарственньк препаратов (хинидина и трифторперазина) на состояние мембраны. В табл. 2 приведены результаты влияния хинидина и трифторперазина на проницаемость мембраны эритроцитов для кальция и концентрацию кальция в цитоплазме эритроцитов. Т а б л и ц а 2 Число К,нмопь/л (Са наблю - клеток в нМ дений 1 мин 5 1630+182 127+8 5 1619+97 138+7 <0 01 <0 005 (0,001 <0,001 Из этих--результатов видно, что предлагаемый метод позволяет выявить влияние лекарственньк препаратов на состояние мембраны при концентрациях 10 мкМ (хинидин) и 30 мкМ (трифторперазин). При использовании прототипа испытание этих веществ невозможно,так как они обладают собственной флуоресценцией. Эффективность метода заключается в том, что его применение позволяет выполнять исследование проницаемости мембран с высокой точностью. Обследовано 35 больных гипертонической болезнью, 12 больньк с вторичными формами артериальной гипертензии и 46 лиц контрольной группы, не имеющих симптомов артериальной гипертензии и указаний на наследственную отягщенность этим заболеванием. Результаты измерений приведены в 5 1429020 6 Т а б л и ц а 3 и упрощения способа, добавляют изотоп 4 Са в концентрации 1,0ппа боль- Скорость (Са 1 4,0 мкКи/мл, регистрируют содержание входа нМ его в эритроцитах через 15-20 мин кальция, 5 и 240-260 мин инкубации, определяют имоль/л. удельную активность в среде инкубации клеток . и объем эритроцитов, при этом пронив1 мин цаемость мембраны определяют по формуле Контрольная 46 980+41 98+5 Число наблюдений A t5 -Хо а" V t Б ьные гипер" т нической бо35 1225+50* 110+б 15 л знью Б ьные втор ной гип ртензией 12 1030+47 97+5 "р < 0,001. 20 рмула изобретения Составитель А. Пецко Техред МаДидык Корректор В. Вутяга Редактор С. Пекарь Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета сны по делам изобретений и открытий 1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5 Заказ 5118/41 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 На основе статистического анализа в дно, что скорость входа кальция в э итроциты больных гипертонической б лезнью увеличена по отношению к к нтролю на 257 (р (О, ÎÎ1), что ука25 з вает на существование структурноф1нкниананьньсс нарушений. Так как отчий по этому параметру не обнаружен у больных вторичными формами гиперт нзии, то можно заключить, чте изл женные материалы могут быть использ ваны для диагностического теста на и едмет разделения гипертонической б лезин и вторичных форм гипертензии. Способ определения проницаемости м мбраны эритроцитов и концентрации к ьция в цитоплазме путем насыщения 40 креток высокоселективным хелатором кальция, отличающийся тем, что, .с целью повышения точности где К вЂ” проницаемость мембраны эритроцитов, нмоль/л клеток в 1 мин; А - радиоактивность Са в эрит45 . 15 -2о роцитах через 15-20 мин инкуб ации, cplll а — удельная активность Са в среде инкубации, cpm/íìoëü; Ч вЂ” объем эритроцитов в пробе, л; — время инкубации, мин, а Концентрацию свободного кальция в цитоплазме определяют по формуле (С 2+ ) — К A 240 -Z60 В-А 240 -Z6> где (Са ) — концентрация свободного Ф кальция в цитоплазме,нМ; К -115 нМ вЂ” константа сродства кальеС ция к 9-аминодиметилкарбокси-7-метокси-2-(3-окси4-аминометилкарбоксифенил)-хинолину; А, „,„- радиоактивность 46Са в 24Î - Z6o " эритроцитах через 240— 260 мин инкубации;  — концентрация 9-аминодиметилкарбокси-7-метокси-2(3-окси-4-аминометилкарб° . оксифенил)-хинолина, нмоль/л клеток в 1 Ml H °
