Способ получения конъюгатов ферментов и антител для иммуноферментного анализа

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУЬЛИН с594 G 01 N 33 5.3 д 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ею i

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4035109/28-14 (22) 12.05.86 (46) 07.10.88. Бюл. У 37 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР и Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов (72) В.В. Синицын, И.Ю. Сахаров, И.Е. Макарова, О.Г. Саканделидзе, Г.А. Ермолин, Г.Е. Синельников и Л.В. Курманова (53) 612.015(083.8) (56) J. Immunology., 1972, х. 109, р. 129-135; (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ

ФЕРМЕНТОВ И АНТИТЕЛ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (57) Изобретение относится к медицине, касается биоорганической химии, „„SU» 1429026 А1 способов получения конъюгатов: ферментов и антител для иммуноферментного анализа. Цель иэобретения— сокращение времени целевого продукта.

Для этого конъюгациж.. ферментов с антителами проводят в воде либо в

О, 15 M NaC1 при рН 4,0-9,0, добавляя р-р соли переходного металла (Сгс1з»

«6Н <О) . Реакционную смесь перемешивают 5-20 мин и диалиэуют против

0,15 М ИаС1. Отбирают аликвоты реакционной смеси (2 мкг антител) и наносят их в лунки планшета для иммунологического анализа, покрытые предварительно антигеном. После инкубации в течение 1 ч и промывки 0,01 M фос- ф фатным буфером, содержащим 0,15 М

NaC1 и D,057 твин-20, определяют фер- Щ ментативную активность сорбированного конъюгата.

1429026

Изобретение относится к медицине, а именно к биоорганической химии, и жасается способа получения конъюгатов ферментов и антител для иммунофермент-5 ного анализа. целью изобретения является сокращение времени получения целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Конъюгацию ферментов с антителами

Ino предлагаемому методу проводят в воде либо в 0,15 М NaC1 при рН 4.,09,0, добавляя раствор соли переходно- 15

ro металла (CrCl> 6Н О). Реакционную

, смесь перемешивают 5-20 мин, после чего диализуют против 0,15 M NaC1., За реакцией следят, отбирая аликвоты реакционной смеси (2 мкг антител), 20 ! и наносят их в лунки планшета для иммунологического анализа, покрытые предварительно антигеном. После инку-бации в течение 1 ч и промывки 0,01 М фосфатным буфером, содержашим 0,15 М 25

NaC1 и 0,05 твин-20, непосредственно определяют ферментативную активность сорбированного коньюагата.

Пример 1. А. Синтез конъюгата щелочной фосфатазы и антител с по- 30 мощью Сг +

К 250 мкг щелочной фосфатазы (ЩФ) тюленя (удельная активность 1200 ед на 1 мкг белка), растворенной в .

250 мкл 0,15 М NaC1, содержащем 0,01 М35

MgClq,(ðH 9,0) прилили 21 мкл антител против IgG человека с концентрацией

Ь мг/мл, находящихся в растворе 0,15 М

NaC1, и 19 мкл З -ного раствора CrC1>.

Конечная концентрация Cr составила

2 мг/мл. Реакция протекала при комнатной температуре 20 мин. Реакционная смесь .была диализована против

О, 15 М раствора NaC1 содержащего

0,001 М М С1 в течение 2 ч при комнатной температуре. Полученный конъюгат был разведен в 10 раэ 0,02 M трис-НС1 буфером, 0,01 М MgC1), 5 альбумина сыворотки человека (НБА) рН Ц,О, содержащим 0,01 / NaN>.

Б, Постановка реакции энзим-меченых антител (p3MA) с полученным коньюгатом.

1. Иммобилизация антигена на твердую фазу. В лунки микротитровального планшета вносили по 200 мкл раствора антигена с концентрацией белка

20 мкг/мл в 0,01 M карбонатном буфере (pH 9,6) и инкубировали в течение

4 ч при комнатной температуре, После инкубации планшеты отмывают от несвязавшегося антигена. В качестве контроля вместо антигена использовали бычий сывороточный альбумин (BSA) °

2. Отмывка планшетов. Содержимое лунок удаляли и планшеты тщательно отмывали от неприсоединившегося белка струей водопроводной воды. Затем лунки заполняли отмывающей жидкостью (водопроводная вода, содержащая 0,05Х твина-20) и вновь споласкивали водопроводной водой. Процедуру отмывания

„повторяли трижды.

3. Внесение в планшет конъюгата (антител, меченых ферментом). Конъюгат вносили по 200 мкл в лунки планшета. Начальное разведение конъюгата было 1:25 с последующим шагом 2, Ин- кубация в течение 1 ч при 37 С.

4. Отмывка планшета (см. п. 2). . 5. Внесение субстратной смеси.

Субстратной смесью для ЩФ является

10 мМ раствор паранитрофенилфосфата в i М диэтилоламине, рН 9,8. Субстратную смесь в объеме 200 мкл вносили в каждую лунку планшета. Икубация при комнатной температуре в течение

45 мин.

6. Остановка ферментативной реакции. В каждую лунку планшета с субстратнои смесью добавляли по 50 мкл

1 М NaOH.

7. Регистрация результатов реакции. Оптическую плотность субстратной смеси в каждой лунке измеряли на микрофотоэлектрокалориметре при длине волны 405 нм. Оптическая плотность в лунках с иммобилизованными IgG была D> 4«„ = 1,2, что соответствует

190 нг, в то время как в лунках с иммобилизованными BSA П „=405 нм =

=0,15, что соответствует 30 нг.

В. Подбор оптимальной концейтраз+ ции Cr для конъюгирования антител с ЩФ.

Подбор. проводился в опытах с небольшим количеством белков. В каждую лунку вносили 20 мкл ЩФ с концентрацией 40 мкл/мл, 20 мкл антител к

IgG с концентрацией 20 мкл/мл и 10 мкл раствора Cr в таких концентрациях, 3+ чтобы конечная концентрация ионов хрома в реакционной смеси была соответственно 1, 2, 3, 4 и 5 мг/мл.

Реакционную смесь инкубировали

40 мин при комнатной температуре.

Затем содержимое каждой лунки (50 мкл) 142902 переносили в лунку с предварительно иммобилиэованным антигеном. Инкубировали 1 ч при 37 С. Отмывали планшет и вносили субстратную смесь. з+ .5

Оптимальная концентрация соли Cr соответствовала наибольшей оптической плотности и составила 2 мг/мл.

Пример 2. А. Получение конъюгата глюкозооксидаэы и антител

3+ с помощью Cr

К 500 мкл очищенной глюкозооксидазы с концентрацией 4 мг/мл, находящейся в 0,15 М NaC1 (pH 7,0), прилили

250 мкл антител к IgG с концентраци. — 15

Ь ей 4 мг/мл в 0,15 М ЛаС1 и раствора

СгСЕЗ до конечной концентрации

5 мг/мл.

Реакция протекала при комнатной температуре 20 мин, после чего полученный конъюгат был отдиалиэован против 0,15 М 11аС1 в течение 2 ч при комнатной температуре.

Б. Постановка РЭМА с полученным конъюгатом. 25

1. Иммобилиэация антигена на твердую фазу. В лунки микротитровального планшета вносили по 0,15 мл антигена с концентрацией белка 14 мкг/мл в карбонатном буферном растворе (рН 9,6) о и инкубировали ночь при t - =4 С.После инкубации планшет отмывали от несвязавшихся антигенов водопроводной водой, содержащей 0,057 твин-20. Два ряда планшета сенсибилизировали IgG человека и два ряда BSA.

2. Внесение в планшет конъюгата.

Конъюгат вносили по 150 мкл в лунки планшета. В кажную лунку было внесено 1,5 мкг белка. Инкубация 1 ч при

37 С, а затем отмывка планшета от несвязавшегося белка.

3. Внесение субстратной смеси.

Субстратную смесь для глюкозооксидазы готовили следующим образом 2 m ор- 4 тофенилендиамина, 200 мг глюкозы и

1 мг пероксидазы растворяли в 20 мп фосфатно-солевого буфера (рН 7,4).

Субстратную смесь в объеме 150 мкл вносили в каждую лунку планшета. Инкубировали при комнатной температуре в течение 7 мин.

4. Остановка ферментативной реакции. В каждую лунку планшета к субстратной смеси добавляли по 59 мл э5

50Х-ной серной кислоты.

5. Регистрация результатов реакции.

Оптическую плотность субстратной смеси в каждой лунке измеряли íà Dyna"

4

tech auto Ehsareader при длине волны

492 нм. В результате реакции получали, что оптически плотность в лунках с иммобилизованными Е С была П =

1,0, что соответствует 180 нг доставленного на планшет фермента, в то время как в лунках с иммобилизованными ВБА Р = 0,08, что соответствует

5 нг фермента.

В. Определение степени связывания фермента с антителами при приготовлении конъюгата.

На колонку с IgG наносили конъюгат глюкозооксидазы антителами к

IgG с активйостью глюкозооксидазы, соответствующей 30 NKF очищенного фермента. В растворе, прошедшем через колонку, с помощью субстратной смеси, содержащей ортофенилендиамин, II 0 и пероксидазу, определяли активность глюкозооксидаэы. Сошедшая с колонки активность фермента соответствовала 12 мкг глю..оэооксидаэы. Следовательно, при получении конъюгата в комплексе фермент-антитело связывается 60Е фермента.

Пример 3. А. Синтез конъюгата пероксидазы с антителами с по3 мощью Cr

К 300 мкл очищенной пероксидазы из хрена (с концентрацией 5 мг/мл, находящейся в 0,15."1 NaCI рН 4,0) прилили 150 мкл антител к IgG с концентрацией 5 мг/мл в 0,15 М NaCI (рН 4,0) и раствор .CrC1 до конечной концентрации 4 мг/мл. Реакция протекала 10 мин при комнатной температуре, после чего полученный конъюгат был отдиализован против 0,1.5 М NaC1 в течение 2 ч при комнатной температуре °

Б. Постановка РЭМА с полученным конъюгатом, Постановка РЭМА осуществлялась так же, как описано в приме-! рах 1 и 2. Субстратной смесью для пероксицазы является ортофенилендиамин, растворенный в метиловом спирте. На

20 мл цитратного буферного раствора (рН 4,7) брали 200 мкл смеси орто- . фенилендиамина + метанол и добавляли

2 мкл 30 -ной Н О . Субстратную смесь в объеме 100 мкл вносили в лунки планшета. Инкубировали при комнатной температуре 20 мин. Для остановки реакции к субстратной смеси добавляли по 25 мкл 507-ной серной кислоты.

Регистрация результатов проводилась путем измерений оптической плотности

5 субстратной смеси íà Dynatecii auto

EPsareader при длине волны 492 нм.

142902б 6 вестном способе это время составляет

2 ч.

Составитель С. Мельникова .Техред N.Äèäûê Корректор О. Кравцова

Редактор С. Пекарь

Заказ 5118!41

Тираж 847

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г ° Ужгород, ул. Проектная, 4

В результате реакции получили,что оптическая плотность в лунках с иммобипизованным IgG была D gag = 1, 5, чт!о соответствует 220 нг доставленного на планшет фермента, в то время как в лунках с иммобилизованным ВЯА

D = 0 01, что соответствует 10 нг ф рмента. !

Время получения конъюгатов до удал ния сшивающего агента составляет о 5 до 20 мин, в то время как в изФормула изобретения б

Способ получения конъюгатод ферментов и антител для иммуноферментного анализа путем инкубации ферментов с антителами в присутствии сшивающего агента, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени получения целевого продукта, в качестве сшивающего агента используют хлористый хром, а инкубацию проводят с ан тителами к IgG при рН 4,0-9,0.