Способ определения чувствительности замедленного типа к микробам

 

Изобретение относится к медицине, касается аллергологии и иммунологии. С целью повышения точности способа и сокращения сроков проведения анализа из лимфоидных органов и периферической крови сенсибилизированных морских свинок получают суспензии лимфоцитов, дважды отмывают их в среде 199 и доводят концентрацию до 2-10 /мл. Соединяют равные объемы лимфоцитов и эритроцитов кролика в концентрации lOO-10VMn (маркер Т- клеток морской свинки), инкубируют 5-10 мин при 37°С, 5 мин центрифугируют при 20°С, вьщерживают 1 ч при и учитывают результаты реакции. Дня этого осадок ресуспендируют, каплю смеси помещают в счетную камеру и под световым микроскопом с увеличением х200 подсчитывают число розе- g ток (лимфоцит с 3 и более прикрепленными эритроцитами) на 100 лимфоцитов(. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (5)) 4 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

М AST0PCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4157620/28-14 (22). 09 ° 12 а86 (46) 07. 12.88. Бюл. У 45 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и инфекционных болезней (72) Ж.С. Нугманова, Д.С. Нугма нова, Г.С. Суходоева и Л. П а Царевский (53) 6 15 ° 375(088. 8) (56) Новиков Д.К., Новикова В.И. .Клеточные методы иммунодиагностики.

Минск: Беларусь, 1979, с. 117-136. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА К МИКРОБАМ (57). Изобретение относится к медицине, касается аллергологии и иммучологии .

С целью повышения точности способа и сокращения сроков проведения ана„„SU„„1442918 А 1 лиза из лимфоидных органов и периферической крови сенсибилизированных морских свииок получают суспензии лимфоцитов, дважды отмывают их в среде 199 и доводят концентрацию до

2 10 /мл ° Соединяют равные объемы лимфоцитов и эритроцитов кролика в концентрации 100 10 /мп (маркер Тклеток морской свинки), инкубируют

5-10 мин при 37 С, 5 мин центрифугируют при 20 С, вьдерживают 1 ч при

4 С и учитывают результаты реакции.

Для этого осадок ресуспендируют, каплю смеси помещают в счетную камеру и под световым микроскопом с увеличением х200 подсчитывают число розе- ф ток (лимфоцит с 3 и более прикрепленными эритроцитами) на 100 лимфовитовэ Q) 1442918

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к аллергологии и иммунологии.

Цель изобретения — повышение точности способа и сокращение сроков анализа, Способ осуществляют следующим образом.

Иэ лимфоидных органов и пери0ери- 10 ческой крови сенсибилизированных морских свинок получают чистые суспензии лимфоцитов. Тимус и селезенку или лимфоузлы (выборочно) гомогенизируют, Фильтруют через двойной слой кап- 15 ронокой сетки. Лимфоциты периферической крови выделяют в градиенте плотности фиколл-верографин, (плотность 1,077 г/мл). Затем суспензии лимфоцитов дважды отмывают средой 20

199, доводят концентрацию до 2 107мп

Соединяют равные объемы лимфоцитов и эритроцитов кролика в концентрации

100х10 /мл (маркер Т-клеток морской

6 свинки), инкубируют 5-10 мин при

37 С, центрифугируют 5 мин при 20 С, выдерживают при 4 С 1 ч, после чего учитывают результат реакции. Для этоо осадок ресуспендируют, каплю смеси помещают в счетную камеру и в 30 световом микроскопе с увеличением х200 подсчитывают число розеток (лимфоцит с 3 и более прикрепленными эритроцитами) на 100 лимфоцитов.

Для диагностики повьппенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ) достаточно определить количество Т-клеток в тимусе и в одном из периферических лимфоидных органов: селезенке, лимфоузлах или крови. 40

Пример 1. Морских свинок сенсибилизируют введением 5 млрд микробных клеток в смеси с неполным адъювантом Фрейнда в подушечки задних лап.

Сенсибипизацию морских свинок осуще- 45 ствляют введением следуюпдх микроорганизмов: 6-гемолитического стрепто кокка группы А; золотистого эпидермального и сапрофитического стафилококков. На высоте сенсибилизации (через 4-5 недель) определяют количество Т-клеток в лимфоидных органах и крови, ставят кожно-аллергические реакции замедленного типа и реакции торможения миграции лейкоцитов

55 (РТМЛ).

Дополнительно проводят общепринятые кожно-аллергические реакции замедленного типа на внутрикожное введение специфических аллергенов и реакцию торможения миграции лейкоцитов по известному способу под действием соответствующих аллергенов, которые были положительными при учете через

24 ч у животных, сенсибилизированных всеми используемыми в опытах микроорганизмами. Т.е. по данным этих тестов у животных всех групп индуцировалась ПЧЗТ. При использовании же предлагаемого способа статически значимое снижение количества Т-клеток в тимусе и повышение их числа в селезенке, лимфоузлах и крови наблюдалось только у морских свинок, сенсибилиэированных стрептококком гемолитическим и стафилококком золотистым.

Для подтверждения достоверности результатов, полученных по предлагаемому способу, быпо проведено гистоморфологическое и гистохимическое исследования на наличие ПЧЗТ в исследованных группах животных. По данным гистоморфологии, ПЧЗТ формировалась только у животных, сенсибилизированных 8-гемолитическим стрептококком и золотистым стафилококком. Марфофункциональные изменения у морских свинок этих групп характеризовались системными. стереотипными реакциями сосудов преимущественно венозного типа, активацией клеток соединительной ткани и появлением однородных мононуклеарных инфильтратов. Типична картина деструктивного эндоваскулита, некротизирующего мезеваскулита и продуктивного периваскулита, формирование которого обусловлено муфтообразными скоплениями сенсибилизированных Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов. Кроме того, реакция ПЧЗТ документируется иммуноморфологическими перестройками в лимфоидной системе с активацией клеток зон — представителей Т-лимфоцитов и высокой их пролиферацией, а также повышенной миграцией через посткапиллярные венулы, в связи с чем имелись очаги делимфатизации. У морских свинок, сенсибилизированных эпидермальным и сапрофитическим стафилококками, не выявлено морфологических изменений, характерных для ПЧЗТ. У этих животных установлены сосудисто- воспалительные изменения во всех органах, В очаt ax воспаления вокруг сосудов и в строме формировались инфильтраты из

Формула изобретения

Составитель В.Литовченко

Редактор Е.Папп Техред Л.Сердюкова Корректор Л.Пилипенко

Заказ 6379/42 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 з

14429 полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) и макрофагов, отражающие выраженность воспалительного процесса, В лимфоидной системе обнаруживалась картина

5 невыраженных тимусзависимых и тимуснезависимых зон, среди клеток в которых имелись ПМЯЛ. Через высокий эндотелий посткапиллярных венул мигрировали ПМЯЛ и лимфоциты. С использованием предлагаемого способа анализ осуществляют в течение 2-3 ч, в то же время по известному затрачивается

18-24 ч, Упрощение способа по сравнению с известным заключается в том, что исключается этап инкубации выделенных лимфоцитов с исследуемым микробом.

Таким образом, предлагаемый способ 20 диагностики ПЧЗТ по наличию совокупности признаков — снижению числа Т-. лимфоцитов в тимусе и повышению в одном из периферических лимфоидных органов или крови — достоверно коррели- 25 рует с результатами гистоморфологи18

4 ческого исследования в отличие от кожных проб и РТМЛ и позволяет проводить диагностику ПЧЗТ эффективно, быстро и относительно просто.

Способ определения чувствительности замедленного типа к микробам, включающий сенсибилизацию животных исследуемыми микробами, забор крови, выделение лейкоцитов с последующим иммунологическим исследованием, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью сокращения сроков анализа и упрощения способа, у животного дополнительно выделяют лейкоциты из тимуса, селезенки, или пахового, или шейного лимфоузлов, определяют уровень Т-лимфоцитов в реакции розеткообразования и по снижению количества Т-лимфоцитов в тимусе и по повышению их числа в селезенке или в лимфоузлах, или в крови определяют наличие чувствительности замедленного типа.