Способ определения аминоглютетимида в биологической жидкости

 

Изобретение относится к медицине , касается методов определения лекарственных препаратов, например аминоглютетимида, в биологических жидкостях . С целью упрощения и повышения точности способа проводят диазотирование аминоглютетимида и азосо- . четание с 0,05%-ным К-(1-нафтил)- этилендиамин-дигидрохлоридом. Полученное диазопроизводное аминоглютетимида определяют спектрофотометрически (или фотометрически) при 7( 560 нм. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Г5ц 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4082830/28- 14 (22) 07.04.86 (46) 30. 01. 89. Бюл. И - 4 (7 t ) Ленинградский научно-исследовательский институт детских инфекций (72) Л,Н.Буловская, В.В.Белова и Г.Н.Борисенко (53), 612.015 (088.8) (56) J.Chromatography, 1984, V.Ç, 10, N 2, "р. 431-437. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОГЛЮТЕТИИИДА В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ИЩКОСТИ

Изобретение относится к медицине, в частности к методам определения лекарственных препаратов в биологических жидкостях, и касается способа определения аминоглютетимида. 5

Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа.

Цель достигается за счет проведения диазотирования аминоглютетимида и азосочетания с 0,05Х-ным N-(1-нафтил)-этилендиамин-дигидрохлоридом (НЭД). Полученное диазопроизводное аминоглютетимида определяют спектро,фотометрически (или фотометрически) при длине волны 560 нм. 15

Способ осуществляется следующим образом, В центрифужные пробирки, содержащие 1,4 мл дистиллированной воды, приливают по 0,1 мл крови или мочи

20 (предварительно разведенной в 5 раз), перемешивают и приливают 0,5 мл

20Х-ной трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешивают, оставляют

„,SU„„1455307 А 1 (57) Изобретение относится к медицине, касается методов определения лекарственных препаратов, например аминоглютетимида, в биологических жидкостях. С целью упрощения и повышения точности способа проводят диазотирование аминоглютетимнда и азосо- . четанив с 0,05Х-ным N-(1-нафтил)этилендиамин-дигидрохлоридом. Полученное диазопроизводное аминоглютетимида определяют спектрофотометрически (или фотометрически) при h

=560 нм. 2 табл. на 5-10 мин, центрифугируют 20 мин

3000 об/мин. Центрифугат разливают в две пробирки (не очень широкие) по 0,5 мл, прибавляют в каждую по

О, 1 мл 4 н. НС1 и перемешивают, Одну из пробирок закрывают фольгой и ставят в кипящую водяную баню на

45 мин. Все пробирки (гидролизованные и негидролиэованные) охлаждают в обычном холодильнике при 4 С в течение 30 мин, затем прибавляют по

0,1 мл свежеприготовленного 0 2Хного NaNO<, встряхивают, через 4 мин приливают 0,1 мл 1Х-ного аммония сульфановокислого, встряхивают, через 2 мин приливают 0,2 мл 0,05Х-ного

НЭД, встряхивают, ставят на 1 ч втемное место, периодически энергично встряхивают. Фотометрируют при

560 нм, путь луча 1 см. Количество аминоглютетимида рассчитывается по калибровочной кривой. Для ее построения в пробы вместо крови или мочи з

145 ! приливают О, 1 мл стандартного раствора с известным содержанием аминоглютетимида от 1,0 до !0 мкг (табл.1).

По стандартной кривой находят количество аминоглютетимида, соответствующее полученной экстинкции при onределении, т.е. количество аминоглютетимида в мкг, содержащееся в

О, 1 мл крови (или в мг в 100 мл

; крови), а для мочи это количество умножается на разведение мочи в 5 раз и на суточный объем мочи.

При обследовании животных и человека, принимавших аминоглютетимид, были получены результаты, представленные в табл,2.

Аминоглютетимид вводили животным внутрибрюшинно натощак в .количестве

20 мг на 1 кг веса, кровь брали в гепаринизированные пробирки через

2 ч после введения.

В лечебных целях аминоглютетимид

° применяли рег ов по 250 мг 4 раза в сутки, кровь брали утром натощак через 2 ч после последнего приема препарата. !

Мочу в обоих случаях собирали в течение суток.

Пример 1. Определение концентрации аминоглютетимида в крови, У человека, принимающего в лечебных целях аминоглютетимид,взяли

О 1 мл крови из пальца утром натощак, внесли ее в центрифужную пробирку, содержащую 1,4 мл дистиллированной воды, перемешали и прилили

0,5 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешали стеклянной палочкой и центрифугировали

20 мин при 3000 об/мин, Центрифугат разлили по 0 5 мл в 2 пробирки (не очень широкие) с внутренним диаметром 8-10 мм, чтобы не было значительного испарения проб при нагреве), В обе пробирки приливали по 0,1 мл 4 н. НС1, перемешали, одну из них закрыли фольгой и поставили в водяную баню (кипящую) на

45 мин, другую оставили при комнатной температуре. Через 45 мин пробу вынули из водяной бани, некоторое время охлаждали на возбухе и обе пробирки поместили в обычный холодильник (t=4 С) на 30 мин, после чего провели диазотирование путем прибавления в пробы по О, 1 мл 0„2 -ного

NaNO, через 4 мин ° убрали избыток нитрита О, 1 мл 1 -ного аммония суль5307

25 фаминовокислого, а через 2 мин провели азосочетание,. приливая 0,2 мл

0,05 -ного N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида. Пробы оставили на

1 ч в темноте, периодически встряхивая для удаления пузырьков газа. Через 1 ч их фотометрировали при длине волны 560 нм. В гидролизованной пробе определили общий аминоглютетимид, в негидролизованной — свободный, т.е. неацетилированный, аминоглютетимид.

По разности между общими и свободным аминоглютетимидом определили количество ацетиламиноглютетимида. Расчет вели по калибровочной кривой со стандартными растворами аминоглютетимида, содержащими 1,25; 2 5; 5 0; 7,5 мкг аминоглютетимида в О, 1 мл крови.Han— ример, величина экстинкции в гидролизованной пробе 0,190, что соответствует по стандартной кривой 3,5 мкг, а в негидролизованной — О, 120, что соответствует 2,5 мкг, следовательно, количество общего аминоглютетимида в крови равно 3,5 мг в 100 мл, а свободного — 2,5 мг в 100 мл, количество ацетилированного аминоглютетимида 1,0 мг в 100 мл.

Пример 2, Определение концентрации аминоглютетимида в моче.

У человека, принимающего аминоглютетимид, собрали суточную мочу, развели ее дистиллированной водой в

5 раз и 0,1 мл разведенной мочи обработали так же, как О, 1 мл крови (см. пример 1), При расчете полученный результат умножили на разведение мочи и на суточный объем мочи.

Формула изобретения

Способ определения аминоглютетимида в биологической жидкости, путем определения белка, обработки супернатанта реагентами с последующей спектрофотометрней, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, супернатант разделают на две пробы, обрабатывают их трихлоруксусной кислотой, затем одну из проб гидролизуют при кипячении, в качестве реагентов используют азотистокислый натрий и N (1-нафтил)-этилендиамин-дигидрохлорид, обработку которыми проводят последовательно в течение не именее четырех минут первым и

5 1455307 6 не менее часа — вторым, а аминоглю- тинкции гидролизованной и негидролитетимид определяют как разность в экс- зованной проб при длине волны 560 нм.

Таблица 1

Величина экстинкции при определении аминоглютетимида в стандартных растворах с разной концентрацией N-(1нафтил)-этилендиамин-дигидрохлорида

Аминоглю- Оптическая тетимид плотность

0,057.-ного нэд

Е 560 нм (1=1 см) О, 17.— ного НЭД

1,25

2,50

5 00

Таблица 2

Аминоглютетимид

КолиОбъект чество обслеСвободный Ацетилированный

Общий дованных

Мыши

Кровь

1,42+ 0,09 0,92+ 0,06 0,50+ 0,05

Крысы

Кровь

0 74+ 0,06 0,40+ 0,03 0,34+ 0,04

0,931+0,120 0,209+0,036 0,722+0,085

Моча

Человек 2

Кровь

О, 19

0,91

1,10

0,28

0,95

1,23

270, О

220, О

Моча

Примечание. Кровь-мкгв100мл; моча — мг/сутки.

Составитель А.Агуреев

Редактор Л.Пчолинская Техред М.Дидык Корректор Н,Король

Заказ 7452/53 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Го"óäàðñòâåííîãî комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород,. ул. Проект ая, ектная 4

О, 065

0, 120

О, 262

470,0

338,0

О, 064

О, 117

О, 291

200,0

118,0