Способ определения жизнеспособности микроорганизмов

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к технике бактериологического анализа. Целью изобретег: НИН является повьшение точности и достоверности определения за счет стабилизации условий роста колоний. Для этого плотные питательные среды, на которых нанесены суспензии микроорганизмов , заземляют, что обеспечивает снятие возниканяцего при перераспределении влаги между пробой и средой электрического заряда и уравнивание условий образования колоний одиночными клетками. Для осуществления заземления плотных питательных сред, разлитых-в стеклянные чашки Петри, предназначено приспособление состоящее из электропроводной крьшки со штырем, контактирующим с питательной средой, и заземленного металлического поддона, через которые осу- . ществляется отток возникающего заряда . 4 табл. ю (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1458389 А1 (51) 4 С 12 q 1/ОО,С.12 N 1/ОО//

//С 12 N 13/00//С 12 М 1/34

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4150268/28-13 (22) 04.09.86 (46) 15.02.89. Бюл. 1Е 6 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (72) В. С. Андреев, Е. С. Горшенина и В.Г.Попов (53) 663.15 (088.8) (56) Koch R. Lur Untersuchung чоп

pathogenen 0rganismen. Nittheilungen

aus dern Kaiserlichen Lesundheitsamte, 1881, р. 1-48.

Кох А. Измер ение роста. В кн.

Методы общей бактериологии/Под ред.

Ф.Герхардта и др. M.: Мир, )983, т. 1,, с. 461. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООР ГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к биотех1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технике бактериологического анализа.

Цель изобретения — повышение точности и достоверности апределения за счет стабилизации условий роста колоHHH

Сущность способа заключается в том, что в процессе культивирования микроорганизмов осуществляют снятие возникающего электрического заряда с плотной питательной среды с нанесенной на ее поверхность суспензией микроорганизмов.

Чашки Петри с плотной питательной средой с нанесенной на ее поверхнологии, а именно к технике бактерио.= логического анализа. Целью изобрете=: ния является повышение точности и достоверности определения sa счет стабилизации условий роста колоний. Для этого плотные питательные среды, на которых нанесены суспензии микроорганизмов, з аземляют, что обеспечивает снятие возникающего при перераспределении влаги между пробой и средой электрического заряда и уравнивание условий образования колоний одиночными клетками. Для осуществления заземления плотных питательных сред, разлитых в стеклянные чашки

Петри, предназначено приспособление состоящее из электропроводной крышки со штырем, контактирующим с питательной средой, и заземленного металлического поддона, через которые осуществляется отток возникающего заряда. 4 табл. ность суспензией микроорганизмов закр {;ф рывают стерильными крышками,, изготов- ф ) ленными из электропроводного материа- 0 ла, так, чтобы был электрический контакт между питательной средой и крышками, через которые осуществляется заземление питательных сред с нанесенными микроорганизмами, Засеянные и закрытые крышками чашки помещают в термостат при необходимой температуре на 16-48 ч с сохранением заземпения плотной питательной среды, з асеянной микроорганизмами, на все время инкубации.

Таким образом создается возможность для оттока возникающего электричес145838

3, xovo заряда от микробных клеток на протяжении всего времени образования колоний вплоть до подсчета их количества. Непосредственно подсче

5 колоний производится обычным образом без осложнений, так как чашка, в которой находится плотная питательная среда с выросшими .колониями, изготовлена из стекла и, следовательно, 10 прозрачна для света. Приспособление для создания возможности заземления плотной питательной среды, разлитой

1 в стеклянные чашки Петри,. состоит из крьппки со штырем, изготовленных иэ 15 электропроводного материала, преиму, щественно нержавеющей стали. На эаземленный металлический поддон поме, щают после засева чашки, закрытые металлическими крьпнками. Через штырь . крьппки, который касается плотной пи, тательной среды с нанесенными на ( нее микроорганизмами, корпус крышки и металлический поддон осуществляется заземление плотной питательной ?5 среды.

Пример 1. Кульууру Е.coli

M-17, .выращенную на глюкозо-минеральной среде до концентрации 35 10 кл/мл высевают на среду Эндо. Для высева - 30 производят последовательно,7 десятикратных разведений исходной суспензии в стерильном физиологическом растворе NaC1. 0,1 мл суспензии из

,седьмого по счету разведения пипет-

35 кой наносят на поверхность плотной, питательной среды в каждую иэ двадцати чашек Петри, суспенэию равномерно распределяют по поверхности агара

mIIaTelIeM 10 чашек закрывают Обыч» 40 ными стеклянными крьппкамн, а другие

10 чашек — металлическими крьппками.

Закрытые металлическими крьппками ч шки помещают на заземленный металлический поддон так, чтобы был контакт каждой из металлических крьппек с поддоном, и последний помещают в термостат при 37 С. В этот же термостат помещают засеянные чашки Петри, эакры"

1 тые стеклянными крышками. Через 24 ч. 50 производят подсчет выросших колоний.

В табл.1 приведены результаты количественных высевов культуры клеток

Е.со11. M-17 без снятия (N„) и со снятием (No) статического электричества.

Пример 2 ° Суточную культуру

Pseudomonas maltophilia CCEB 715, выращенную на плотной питательной

4 среде (сухом питательном агаре), смывают стерильным физиологическим раствором NaCl, Полученную суспензию клеток подвергают последовательным десятикратным разведениям и

0,1 мл суспензии из последнего разведения наносят на поверхность плотной питательной среды (сухой . питательный агар) в каждую из двадцати чашек Петри. Суспензию равномерно распределяют по поверхности агара . шпателем, 10 чашек закрывают обычными стеклянными крьппками., а другие !

10 чашек — металлическими крьппками.

Закрытые металлическими крышками чашки помещают на заземленный металлический поддон так, чтобы был кон-. такт каждой иэ металлических крьппек с поддоном, и последний помещают в термостат при 37 С. В этот же термостат помещают засеянные чашки Петри, закрытые стеклянными крьппкамн. Че рез 24 ч производят подсчет выросших колоний.

В табл.2 приведены результаты количественных высевов культуры клеток Ps. maltophilia ССЕВ 715 без снятия (N )и со снятием (N ) статического электричества. а

Пример 3. Суспензию клеток

Е.aегоgenes, приготовленную и разведенную в стерильном физиологическом растворе NaCl как описано в примере 2, в объеме О,1 мл наносят на поверхность плотной питательной среды, разлитой в чашки Петри. После равномерного распределения суспенэии по поверхности агара 10 засеянных чашек Петри закрывают обычными стекляннымн крьппкамн, а другие 10 чашек с нанесенной суспензией - металлическими крышками. Закрытые .металлическими крьппками чашки помещают на заземленный .металлический поддон так, чтобы был контакт каждой Hs металлических крьппек.с поддоном, и последний помещают в .термостат при 37 С. В этот же термостат помещают засеянные чашки Петри, закрытые стеклянными крьппками. Через 30 ч производят подсчет выросших колоний.

В табл.3 даны результаты коли чественных высевов культуры клеток. Е.

aегоgenes без снятия (N ) и со снятиК ем (N ) статического электричества, II р" и м е р 4. Суспензию клеток культуры Ps. аегщ1nosa 889, приготовленную и

298

-14

196

319

309

144

313

303

269

306

625

-25

301

303

276

298

169

-13

289

314

276

-22

305

484

298

Х =3422

N =305

N „=276

X =537

5 14583 разведенную как описано в примере 2, засевают в 20 чашек Петри на поверхность плотной питательной среды. 10 чашек Патри закрывают обычными стек-..

5 лянными крьппками, а другие 10металлическими крьппками. Закрытые металлическими крышками чашки помеща-. ют на заземленный металлический поддон, так чтобы был контакт каждой из 10 металлических крьппек с поддоном, и последний помещают в термостат при

37 С. В этот же термостат помещают засеянные чашки Петри, закрытые стеклянными, крьппками. Через 24 ч произ- 15 водят подсчет выросших колоний.

В табл.4 приведены результаты количественных высевов культуры клеток Ps. aeruginosa 889 без снятия (N ) и со снятием (N о) статического 20 электричества.

Таким образом, использование пред-.. лагаемого способа улучшает точностные параметры, характеризующие разброс результатов, более, чем в 2 ра- 25 за. Для E.coli M-17, например относительная погрешность 2 = 5,8% (при доверительной вероятности р = 0,95) по сравнению с относительной погрешИзвестный .способ (чашки Петри со стеклянными крьппками) М„ЛИ (ЛИЛ.

285 -9 81

243 33 1089

281 -5 25

246 30 900

89 6 ностью „= 16,2% (при р = 0,95) для известного.

Кроме того, абсолютные количества подсчитанных колоний в примерах с использованием заземленных питательных сред оказались на 10-15% выше, т. е. систематическая погрешность, обусловленная гибелью ослабленных клеток при переносе их на плотные питательные среды при снятии заряда (т. е. предлагаемым способом) уменьшается.

Формула из обр ет ения

Способ определения жизнеспособности микроорганизмов, предусматривающий нанесение проб суспензий мик-, роорганизмов на плотную питательную среду, помещенную в чашки Петри, культивирование в термостатируемых условиях с последующим подсчетом выросших колоний, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повьпнения точности и достоверности определения эа счет стабилизации условий роста колоний, питательную. среду в процессе культивирования заземпяют.

Т аблиц а1

Предлагаемый способ (чашки, закрытые мет аллич ескими крьппк ами) 1458389

Й, = 305+18

Н вк о 0,9 йНо = 2,3 7,7 = 17,7

hN 2 ° 3 19 ° 5 4418 оИо 100% о и о (р = 0,95) 1 1 аSî 108Х

- --= — о — — — = 2 8

No у 4 (р = 0,68)

W о

Т аблица2

Известный способ Предлагаемый способ

Н„ N „(лик) N, М, (N )

З

100

306 -15 225

301 - 10 100

315 10

320 5

261 .30 900

334 -9 81

335 -10 100

273 18 324

313 -22 484

321 4

319 -28 784

332 -7 49

144

278 13 169

282 9 81

121

287 4

121

292 -Ф 1

Я=325

X =3084

,Е =761

Nê 291+43

No = 325+21 И о о = 09 =. 9 ° 3 N - 2 3 S - 430

>No 2,3 A Sy = 21,2

Ек -р- IOOX = 14 6Х

ЙМк k 9 (p 0,95) DNo

4 @ . IOOX 6 >7%

1 о (р = 0,95) — 1O0X = 7 0%

1 1о8к (р - 0,68) 1 8о

W = - — - 100 = 3 2 о 1,1 o j о (р = 0,68), Nк 276145

I оSк -- 19 5

dN» 100X

F w w- — — — - I612X

k 1 к (р 0,95) 1 1 ьSк 100%

М -а- — — ---- 7 8

К Nк ф 0 (р 0,68) 313 12

314 ll

336 -11

327 -2

) 458389 l0"

ТаблицаЗ

Известный способ лик (дик

Предлагаемы способ

ы. )

) ) )о . д 1 )о "(aNo)

135 -5 25

169

256

196

133 -3

127 3

142 -12

126 4

144

16

676

49 125, 5 . =3229 N>= 130

118144

- < "- -> - 1S 8 Г ГО

No m m)30123

1 2 — — — 10. 0

$9 10

Nk д$

Дн„2,3 д Як = 43,5 щ = 2,3 д8к 23,0

Eo = 17,7 (р 0,95) о = 8в5Х (р 0,68) Ек Збэ9Ж (р 0,95) 17,6X (p = 0,68) Т аблица4

Известный способ х

Предлагаемый способ

T T дик (д ) ) No 4No (DNo) 262 -12 144

245 5 25

260 -10 100

262 -41 1681

25 .

226 -5

203 18 324

, 216 5 25

198 23 529

211 10 100 .

252 -2

226 24

238 12

576

144

126 -8 64

142 -24 576.

99 19 361

103 15 225

152 -34 1156

109 9 81

122 -4

123 -5

92 26

111 7

Й„118

137 -7

117 13

114 16

144 -14

1458389

Продолжение табл.4

° В ЯЮВЮ ЮЮЮЮ ЮВЮВ стный способ (aN„ ) "Г 1

Предлагаемый способ

Г (ы,)

238 -17 289

250 -29 841

200 21 441

208 13 169

255

256

-16

266

> =44.24

No250

2 =1208

N„=221

221. — 51

Е

3. (bNк 22 2 9 10

N = 250 27 4Н.

as Но = 2э3 aSв 26э7

2,34Sw = 51 0

23,0X (n 0,95) Е, =107X (р =095) 11, 5,1Х (р = 0,68) 11,0Х (р = 0,68.) Составитель И.Привалова

Техред M дндык

Редактор А,Лежнина

Корректор М.Демчик

Производственно-полиграфическое предприятие, r. .Ужгород. ул. Проектная, 4

Заказ 326/29 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва,. Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5