Способ диагностики вирусных гепатитов
Изобретение относится к вирусологии . Цель изобретения - повышение точности диагностики. Суспензию лимфоцитов вносят в пробирки и в четыре из них добавляют вирус гепатита А. В следующие 4 пробирки вносят вирус гепатита В. Все пробы ставят в термостат . Из каждой группы вынимают по пробирке через 5; 30; 60 и 90 мин, добавляют раствор акридинового оранжевого , смешивают и наносят на .предметное стекло. Проводят питофотометрическое измерение препарата. При нарастании флюоресценции более 25% в пробе с вирусом гепатита В диагностируют вирусный гепатит В. Способ позволяет достоверно диагностировать заболевание в стадиях разгара и реконралесценции. (Л
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН
А1 (19) (И) (511 4 C 01 N 33/53
ОПИСАНИЕ ИЗО зРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМ У СОИД ТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
f10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4193313/28-14 (22) 09.02.87 (46) 15.02.89. Бюл. И 6 (71) Рижский медицинский институт (72) А.Ф. Блюгер, Х.М. Векслер, 0.10. Сондоре и. Н.А. Осна (53) 615,375(088.8) (56) Алейник М.Ц., Быстрова Г.Н., Федотов В,А. и др. Изучение структуры заболеваемости вирусными гепати.тами. — В кн.: Актуальные проблемы медицинской вирусологии, — М.: 1985, с. 100-101. (54).СПОСОБ ЦИАГНОС И1(И ВИРУСИыХ
ГЕПАТИТОВ (57) Изобретение относится к вирусологии, Цель изобретения — повышение
Изобретение относится к медицине, касается гепатологии, в частности .. вопросов иммунологической диагностики вирусных гепатитов А {ВГА) и В (ВГВ).
Цель изобретения - повышение точности диагностики вирусных гепатитов.
Способ осуществляют следующим образом.
Из крови выделяют лимфоцитарную взвесь в градиенте плотности фиколлвераграфина. Эту взвесь доводят до концентрации 2 10,кл/мл в растворе
Хэнкса {рН 7,2). В 12 пробирок вносят по 100 мкл суспензии лимфоцитов
6 в концентрации 2 10 кл/мл, в 4 из них добавляют HAAg в концентрации
20 мкг/мл и в 4 пробирки — НВзАя в концентрации 20 мкг/мл {по белку). точности диагностики, Суспензию лим- фоцитов вносят в пробирки и в четыре из них добавляют вирус гепатита А.
В следующие 4 пробирки вносят вирус гепатита В, Все пробы ставят в термостат. Из каждой группы вынимают по пробирке через 5; 30; 60 и 90 мин, добавляют раствор акридинового оранжевого, смешивают и наносят на предметное стекло. Проводят цитофотометрическое измерение препарата. При нарастании флюоресценции более 257. в пробе с вирусом гепатита В диагностируют вирусный гепатит В. Способ позволяет достоверно диагностировать заболевание в стадиях разгара и рекон- Я валесценции.
:Все пробы ставят в термостат при
37 С. По пробирке из каждой группы (контрольные лимфоциты, с HAAg и с НВ Ag), вынимают через 5; 30; 60 и 90 мин, добавляют раствор акрицинового оранжевого (концентрация !
О M на ацетатном буфере, рН 4,4), -Ф смешивают, через 10 мин наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и закрепляют парафином.
Цитофотометрические измерения препарата проводят на зондовом цитофотометре при % =365 нм и длине волны 530 нм. Йа каждом препарате флюоресценцию 30 — 50 клеток измеряют и подсчитывают среднее значение интен-, сивности флюоресценции. Высчитывают нарастание интенсивности флюоресцен14588 ции в опыте по сравнению с контролями и этот показатель используют для диагностики ВГА и ВГВ.
При нарастании флюоресценции бо5 лее 25 в пробе с НВ Ая диагностируют ВГВ, при нарастании флюоресценции . более 25% в пробе с HAAg .диагностируют ВГА.
Пример 1. Больная А. предъяв- 1р ляла жалобы на недомогание, ломоту в суставах, тошноту (e анамнезе три месяца назад внутримышечные инъекции). Объективно: желтушность склер и кожи, повышение уровня бялирубина, АлАТ. Произведено .обследование с помощью известного и предлагаемого способов. При применении способа-прототипа наблюдалось торможение прилипания в опытном (обработанном HB>Ag) Zp образце лимфоцитов по сравнению с контрольным, которое составляло 3%, т.е, получен отрицательный результат.. При использовании предлагаемого способа при инкубации лимфоцитов в кон- 25 центрации 2-10 кл/мл в течение о
60 мин при 37 С с НВэАр интенсивность флюоресценции акридинового оранжевого повысилась на 150%, инкубация лимфоцитов с HAAg в аналогичных ус- 30 ловиях не дала увеличения флюоресценции акридинового оранжевого. Прове— дение предлагаемого способа с использованием лимфоцитов в концентрации
5 ° 10 кл/мл позволило выявить измене- З ние интенсивности флюоресценции акридинового оранжевого на 15 при обработке НВ Ag и отсутствие изменения поД действием HAAg. Таким образом способ позволил диагностировать ВГВ, при этом концентрация лимфоцитов
5 1О кл/мл оказалась неоптимальным условием постановки реакции.
В сыворотке крови больной методом встречного иммуноэлектрофореза выявлен НВ Ая, чем подтверждена правиль" ность выставленного диагноза, Пример 2 ° Больной П. предъявлял жалобы на боли в правом подреберье, тошноту (в анамнезе — парентеральные вмешательства). Госпитализирован с подозрением на вирусный гепатит. Объективно: желтушность кожных покровов и склер, повышение билирубина и АлАТ.
Обследован с помощью известного и предлагаемого способов. При применении способа-прототипа выявлено тор— можение прилипания лимфоцитов под
27
4 влиянием НВц Ag íà 2X — отрицательный результат. При использовании предлагаемого способа в пробе с
НВэАя,20 мкг/мл) наблюдалось повышение интенсивности флюоресценции на 25 . на 30-й мин инкубации при о
37 С; в опытах с HHAg интенсивность флюоресценции не изменилась. При роведении способа в нестандартных условиях (исполь зо ванин НВ5 Ag H KQH центрации 50 мкг/мл) интенсивность флюоресценции повысилась лишь на
15%. На основании данных, полученных предлагаемым способом, был диагностирован ВГВ. Циагноэ был подтвержден тем, что в сыворотке крови встречным иммунозлектрофорезом обнаружен
НВ, Ля.
Пример 3. Больной Б. предьявлял жалобы на слабость, тошноту, боли в правом подреберье. Объектив-. но: желтушность склер и кожи, повышение билирубина и АлАТ. С помощью способа-прототипа не представлялось возможным уточнить диагноз..С помощью предлагаемого способа было обнаружено отсутствие изменений интенсивности флюоресценции при обработке лимфоцитов НВэAg и повышение на 30 связывания акридинового оранжевого под цействием HAAg.
Применение неоптимальных условий
1инкубация лимфоцитов с HAAg и НВ Ац в течение 2 мин) . позволило выявить нарастание интенсивности флюоресценции под влиянием HAAg на ) OX что позволило диагностировать ВГА. Циагноз подтвержден отсутствием НВ Ag в сыворотке крови при регулярном контроле (каждые 1О дней) и обнаружением IgM антигенов-антител .(иммуноэнзимный метод, набор фирмы Эббот).
С помощью способа-прототипа в разгаре ВГВ правильный диагноз был поставлен в 5 из 9 случаев, в реконвалесценции — в 3 из 9 случаев. Способ-прототип не позволяет диагностировать ВГА, поскольку он не адаптирован к использованию антигена вируса гепатита А.
С помощью предлагаемого способа верный диагноз ВГВ и ВГА в период, разгара и реконвалесценции был .поставлен у 100 больных. Правильность диагноза ВГА и ВГВ подтверждена клинико-беохимическими и иммунологическими .исследованиями больных .на протяжении 1-3 мес заболевания.
Составитель В. Литовченко
Редактор Л. Пчолинская Техред Л. Сердюкова Корректор М, Самборская
Заказ 367/5 1 Тираж 788 подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие., г. Ужгород, ул. Проектная, 4
5 1458
Таким образом, предлагаемый способ позволяет достоверно диагностировать вирусные гепатиты А и В в стадиях разгара и реконвалесценции.
Формула и зоб ре тения
Способ диагностики вирусных гепатитов, включающий забор у больного крови, выделение лимфоцитов, добавление HBs антигена и инкубирование, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, 827 6 дополнительно берут пробу с лимфоцитами, добавляют в нее вирус гепатита А, далее обе пробы инкуДируют в течение 5; 30; 60 и 90 мин при 3638 С, далее окрашивают раствором акридинового оранжевого, оцределяют интенсивность флюоресценции ядер и при нарастании флюоресценции по сравнению с пробами без антигенов более чем на 25Х диагностируют соответственно гепатит А или гепатит В.
