Способ определения поливалентного антигена

 

Изобретение относится к иммунохимическому способу определения антигена в жидкой пробе. Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа. 50 нг антител первого порядка и 170 MU МЕЧЕНОГО (FAB)<SB POS="POST">2</SB>-фрагмента этого антитела помещают на слой волокнистой массы, состоящей из полиэфирной бумаги размером 6х6 мм, толщиной 1,0 мм, и высушивают при комнатной температуре. Далее на этот носитель помещают определяемый антиген, центрифугируют и надосадочную жидкость соединяют с антителами второго порядка, связанными с твердой фазой и специфичными к FC-фрагменту антител первого порядка. После инкубирования реакционной смеси ведут определение антигена по индикаторному реактиву в иммуноферментном анализе. Точность способа возрастает за счет повышения чувствительности иммуноферментного анализа до 40 рд/мл. Упрощение достигается тем, что первое антитело и меченое антитело могут быть получены от одного животного.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕспуБлин

yg 4 G 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ мьппи ба.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

По ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ fKHT СССР (21) 3830911/28-14 (22) 28.12.84 (31) P 3400027.5 (32) 02.01.84 (33) ПЕ (46) 23.04.89. Бюл. № 15 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) (72) Манфред Байер, Зигмар Клозе, Хельмут Шлумбергер, Вольфганг Клееманн, Манфред Паш и Фридхельм Фит (ВЕ) (53) 615.373(088 „8) (56) С1in. Chem., 27, б, 1981, 823827. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИВАЛЕНТНОГО АНТИГЕНА (57) Изобретение относится к иммунохимическому способу определения антигена в жидкой пробе. Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа. 50 нг антител перИзобретение относится к иммунохимическому способу определения поливалентного, т.е. по меньшей мере бифункционального, лиганда (антигена) в жидкой пробе.

Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа.

Пример 1. Определение тиреотропина (TSH) .

Рецептор 1 антитела первого порядка и рецептор 3 (меченые Fab-фрагменты антител первого порядка) происходят из одного и того же вида животных (мьппи); рецептор пр едставляет,.SU ÄÄ 1475492 А 3 вого порядка и 170 пг/мл меченого (ЕаЪ) -фрагмента этого антитела помещают на слой волокнистой массы, состоящей из полиэфирной бумаги размером бхб мм, толщиной 1,0 мм, и высушивают при комнатной температуре.

Далее на этот носитель помещают определяемый антиген, центрифугируют и надосадочную жидкость соединяют с антителами второго порядка, связанными с твердой фазой и специфичными к FC-фрагменту антител первого порядка. После инкубирования реакционной смеси ведут определение антигена по индикаторному реактиву в иммуноферментном анализе. Точность способа возрастает за счет повьппения чувствительности иммуноферментного анализа до 40 пг/мп. Упрощение достигается тем, что первое антитело и меченое антитело могут быть получены от одного животного. 2 табл.

2 собой маркированный Fab-фрагмент.

Рецептор 1 представляет собой моноклональное антитело, Fab-фрагмент в рецепторе 3 также происходит из моноклонального антитела, которое ,направлено против другого детерминанта TSH» чем моноклональное антитело рецептора 1, Рецептор 2 происходит из овцы и направлен против

Fc-части моноклонального антитела

Реактивы для осуществления спосо1475492

Инкубационный буфер (IP): 15 ммоль натрийфосфатного буфера, рН 7,14, 154 ммоль NaC1, 5 ммоль EDTA, 0,2Х

TSA, рН 7,4.

Рецептор 1 (антитела первого порядка); анти-Т$Н вЂ” антисыворотка мьппи (рецептор 1). Содержащая моноклональные анти-TSH-антитела асцитная жидкость из,мышей смешивается с коли- 10 чеством до 1,8 М с (NH<) 2 SO<. Осадок растворяется в буфере из 15 ммоль фосфата натрия, рН 7,0, и 50 ммоль

gaC1 и таким образом полученный раствор подвергается пропусканию через . DEAE-целлюлозу.

Рецептор 3 (меченые антитела):

Анти-TSH-антитело (моноклональное), которое распознает другой антигенный детерминат, чем рецептор 1. Конъюгат 20 пероксидазы (рецептор 3): мышиная анти-TSH-антисыворотка очищается как рецептор 1. Последующее получение (РаЬ): из комплектной молекулы антитела осуществляется аналогично. 25

Связывание с пероксидазой хрена.

Рецептор 2 (антитела второго порядка): адсорбирующий материал с фиксированным овца-анти-мышь Гс — антителом (рецептор 2-адсорбер). Овечья антимышиная Fc (-антисьпзоротка смешивается с количеством до 1,8 M c

NH S0<. Осадок растворяют в буфере

1 ил 15 ммоль фосфата натрия, рН 7,0, и 50 ммоль NaC1 и таким образом полученный раствор пропускают через

DEAE-целлюлозу. Содержащую ХдС-фракцию (рецептор 2) связывают с адсорбентом, средства, активированным глутаровым альдегидом Bochringer Mann- 40

heim.

Индикаторный реактив: 1,8 ммоль

ABTS (2,2 -азино-ди(3-этилбензтиазолинсульфонат-б)1, 3,3 ммоль пербора- 45 та натрия в 100 ммоль фосфатно-цитратного буфера, рН 4,4.

Способ осуществляют следующим образом.

А. 50 нг. рецептора 1 и 170 пг/мп рецептора 3, растворенные н цнкубацнонном буфере, накалывают цместе на прочее (слой волокнистой массы), состоящий из полиэфирной бумаги размером бхб мм, толщиной 1,0 мм, и высушивают при комнатной температу55 ре, Содержащее этот реактив бумажное полотно называется реактивным носителем 1.

На реактивный носител ь I нанос ят пипеткой 40 мкл определяемой пробы, содержащей известное количество антигена стандартного раствора, затем прочес (слой волокнистой массы) тот» час отделяют центрифугированием в центрифуге Eppendorf причем реактивный носитель I размещается на Eppendorf колпачке, а элюированная жидкость в колпачке (Hiitchen) во время центрифугирования попадает на рецептор 2, который связан с адсорбером, и реагирует с ним. Из рецептора 2 используется 2,5 мг адсорбированного материала на тест.

На аппаратуре со встряхиванием инкубируется реакционная смесь в течение 15 мин при 37 С.

Спустя 15 мин реакционные сосуды вынимают из аппаратуры и центрифугиpуют 4

Отбирают аликвотную часть надосадочной жидкости с помощью пипетки и определяют образовавшийся краситель по его экстинкции при 405 нм.

С помощью двух различных TSH-проб определяются следующие значения экстннкции, приведенные в табл.1.

Т а блица 1

TSH EU М11

50

9,74

7,54

Значения экстинкции определялись при-толщине слоя 0,2 см и пересчитывались на толщину слоя 1 см., Б. Простой Сэндвич (сравнение).

Осуществляют по А, но 2,5 мг адсорбера — рецептора 2 предварительно инкубируется в течение 1 ч с 20 мкг рецептора I в 0,,2 мп при встряхивании. Затем надосадочная жидкость отсасывается и остаток промывается трижды по 1 мл IP, Таким образом предварительно обработанный рецептором 1 адсорбер-рецептор 2 инкубируется 4 ч с пробой и рецептором 3 в аппаратуре со встряо хиванием при 37 С, причем в этом варианте отпадает добавка растворимого рецептора 1.

Затем надосадочная жидкость отсасывается, остаток промывается и фиксированная активность фермента определяется с помощью индикаторного реактива.

5 14754

С помощью двух различных TSH-проб определяются следующие величины экстинкции, приведенные в табл.2.

Таблица 2

Е, нм/см

TSH p LI Mn

0,20

2,87

30

Чувствительность значительно меньше, чем согласно п.А,.хотя в п.Б используется значительно больше рецептора 1, чем в п. А (соотношение

1:400) .

Пример 2. Определение человеческого хориогонадотропина (HCG) .

Реактивы.

Буфер А: 100 ммоль фосфата натрия, рН 7,3 (37 С), 2 ммоль хлорида магния, 0,97 NaC1, 0,57. RSA (альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота).

120 мкг/мп анти-HCG моноклональ- 26 ного антитела из мыши в виде асцита (рецептор 1) . .100 пг/мл (мп анти-HCG-антитело— (овца) — Fab рагмент-Р -галактозидаза — конъюгат) рецептора 3.

Приготовление Fab-фрагмента осуществляется согласно Т.Kitagawa.

Ковалетное связывание Р -галактозидазы с антителом, соответственно с АК-фрагментом, осуществляется по методу R.P.Poster.

Субстратный раствор: как и буфер А, дополнительно содержит 5 ммоль (0NPG) орто-нитрофенилгалактозида.

Приготовление реактивного носите- 40 ля 1 осуществляется аналогично примемеру 1. 40 мкл раствора А накапывают на слой волокнистой массы (прочес), состоящий из полиэфирной бумаги, и затем высушивают IIpH комнатной тем 4б пературе. Хранение слоя волокнистой массы (прочеса) вплоть до его использования осуществляется при 4 С и относительной влажности воздуха — 20X.

Приготовление реактивного носителя 2 на целлюлозном прочесе (слое волокнистой массы) по способу активирования бромцианом фиксируется (М—

Fc () -антитело овцы (IgG-фракция), причем на 1 r волокнистого материала для фиксации берется 10 мг антитела.

Путем промывки удаляется несвязанное антитело, и прочес (слой волокнистого материала) осторожно высушивают

92 6 при комнатной температуре. Хранение волокнистого материала (прочес) осуществляется аналогично реактивному носителю 1.

Определение НСС осуществляют с помощью реактивных носителей 1 и 2 описанным в немецкой патентной заявке Р 24250085 устройством. Устройство для осуществления аналитических определений включает роторный вставной элемент для центробежных (центрифужных) аналитических автоматов, состоящий из формованного корпуса, который имеет камеру для ввода пробы, связанную с множеством реактив,ных областей, содержащих пропитанный определенным реактивом всасывающий носитель, по крайней мере однукамеру со смесительным клапаном и измерительную камеру, которые вместе образуют транспортировочный путь испытуемой жидкости (жидкости пробы), который идет радиально изнутри до, далее радиально наружу, когда вставной элемент укреплен на роторе, и далее, по крайней мере одну-две камеры для приема жидкости, и транспортировочный путь, который ведет из этой камеры к осуществлению измерения и идентичен по меньшей мере частично транспортировочному пути испытуемой жидкости. При этом транспортировочный путь испытуемой жидкости идет от камеры для ввода пробы (Р) через заполненную поглощающим материалом содержащую буфер zaMepyq, камеру и расположенную между камерами д и с первую клапанную коробку

VKY, к второй клапанной коробке VK и из нее через камеру 1 и через приемную камеру AK в измерительную камеру К. Для принятия дальнейшей жидкости предусмотрена камера, выполненная в виде насосной камеры, для субстрата PK которая через состоящее из дозировочной камеры ДК и капилляра Кар дозировочное устройство и переливную камеру UK связана с второй клапанной коробкой VK2.

При этом реактивный носитель 1 помещается в поле с вставного элемента, а реактивный носитель 2— в поле d . Осуществление реакции соответствует примеру 1. При этом пипеткой вносят 40 мкл пробы через отверстие в верхней части края непосредственно в поле ь . Проба неразбавленная. Высокая скорость вращения

1475492 чередуется с состоянием покоя, затем проба и субстрат движутся в направлении разделительной матрицы и кюветы.

Перенос пробы из поля с в J ocy5 ществляется в течение очень короткого времени («60 с). Ведущий в конечном счете к индикации объем субстрата составляет также 40 мкл, так что никакого разбавления пробы до измере- 10 ния сигнала не происходит, При применении калибровочной сыворотки получается калибровочная кривая, которая охватывает область 0100 пг/мп HCG (мп) стандартизованно по 1-му IRP-стандарту для HCG, .и становится возможным достаточно чувствительное измерение HCG .в сыворотке и плазме.

Пример 3. Определение альфа- 20

1-фетопротеина (AFP).

Применяют маркированный гаптеном рецептор 1 причем все три антитела происходят из одного и того же вида животных 25

Осуществление и используемый буфер соответствует примеру 2.

В качестве рецептора 1 используются анти-AFP-антитело, овцы (t00 нг/мл), которые маркированы дигоксином (со- 30 гласно патенту ФРГ Р 2537129), в качестве рецептора 3 используются анти-AFP — антитела овцы, маркированные Р -галактозидазою согласно примеру 2, и в качестве твердофазно связанного рецептора 2 применяются бумажные диски из полиэфирной бумаги, с которыми адсорбционно связывают антитела против дигоксина овцы.

Способ нанесения покрытия соответствует известному для пластиковых трубочек способу.

Пример 4. Определение тиреотропина (TSH).

Реактивы. 45

Инкубационный буфер (IP): 15 ммоль натрийфосфатного буфера, рН 7,4, 154 ммоль NaC1, 5 ммоль ЕДТА, 0,27

PSA, рН 7,4.

Рецептор 1: овечья анти-TSH — антисыворотка. Неочищенная .сыворотка смешивается с количеством до 1,8 М с

NH S04 . Осадок растворяется в буфере из 15 ммоль фосфата натрия, рН 7,0, и. 50 ммоль NaC1 и таким образом полученный раствор подвергается пропусканию через ДЕАЕ-целлюлозу. Содержащая IgG-фракция затем освобождается от реагирующих с альфа-цепью TSH частей путем пропускания через нагруженный HCG иммуноадсорбер. Элюат подается на нагруженный TSH иммуноадсорбер. После промывки адсорбера происходит элюирование иммунореактивных против TSH антител с помощью 1 M пропионовой кислоты. Элюат затем диализуется по отношению к IP, при,известных условиях концентрируются путем ультрафильтрации.

Рецептор .3: конъюгат антитела— пероксидаза. Дальнейшая овечья антиTSH - антисыворотка очищается как рецептор 1 и затем из нее получают (Fab) -фрагменты. Приготовление (Fab) -фрагментов осуществляется. согласно Е.Zamoye.

Рецептор 2. Материал адсорбера с фиксированным ослиным-антиовечьим

Fc(— антителом. Ослиная-антиовечья

Рс -антисыворотка смешивается в ко личестве до 1,8 М с МЦ ЯО4, Осадок растворяют в буфере из 15 ммоль фосфата натрия, рН 7,0, и 50 ммоль МаС1 и таким образом полученный раствор пропускают через ДЕАЕ-целлюлозу, Содержащую Хяс-фракцию (рецептор 2) соединяют с адсорбентом средства, активированным глутаровым альдегидом

Boehringer Mannlleim (определение р 665525) по рабочей инструкции изготовителя.

Индикаторный реактив: 1,8 ммоль

АВТБ 2,2-азино-ди(3-этилбензтиазолинсульфонат-6)3, 3,3 ммоль пербората натрия в 100 ммоль фосфат-цитратного буфера, рН 4,4.

Способ осуществляют аналогично примеру 1, причем в этом случае 100 нг рецептора 1 и 100 пг/мл рецептора 3, растворенные в инкубационном буфере (40 мкл), накапывают на целлюлозный прочес (слой волокнистой массы) размером бх6 мм. После высушивания хранение прочеса вплоть до применения его снова осуществляют при 4 С.

Дальнейшее осуществление соответствует примеру 1. В качестве пробы используется 40 мкл.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет точнее определять антигены, содержащиеся в малых количествах (40 пг/мл). Кроме того, достигается упрощение способа, так как не требуется получать первый и третий рецепторы из двух различных видов животных

9 1475492 10

Ф о р м у л а и з о б р .е т е н и я конкурентным методом по актинности

Способ определения поливалентного метки, отличающийся тем, антигена, включающий добавление его что, с целью повышения точности и к специфическим моноклональным анти- упрощения способа перед добавлением

У телам или фрагментам антител первого антигена специфические антитела перпорядка, антителам второго порядка, вого порядка и меченые Fab-фрагменты связанных с твердой фазой и специфич- этих антител наносят на твердую фазу, ных к FC-фрагментам антител первого высушивают, далее после добавления порядка, к Fab-фрагментам антител 10 антигена смесь центрифугируют и надпервого порядка, маркированных меткой, осадочную жидкость соединяют с антис последующим определением антигена телами второго порядка.

Составитель Г. Крюкова

Pедактор Н. Тупица Техред М.Дидык Корректор М. Пожо

Заказ 1916/59 Тираж 788 Подпис ное

ВНИИПИ Гасударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101